Huomaa VP40 sijoittuminen nukleoplasmaan, inkluusioihin, sytoplasmaan ja plasmakalvooon 0 - 48 tunnin aikana.

(Edella  on kuva, johon  selvitykset liittyvät)

 Tutkijat kertovat  projektistaan näin:
 http://www.nature.com/srep/2013/130204/srep01206/fig_tab/srep01206_F6.html

 TIIVISTELMÄ

"Tässä käytämme biologisesti  hillittyä Ebolavirus-systeemiä jota saisimme luonnehdituksi spatiotemporaalisen
EBOV proteiinien  ja sen  RNA:n sjoittautumisen soluun  viruksen replikaatiotapahtuman aikana. Me havaitsimme, että viruksen nukleoproteiinia(NP), polymeraasikofaktoritekijää VP35,  pääasiallisinta matrixproteiiinia VP40, transkriptiota aktivoivaa tekijää  VP30 ja pientä  matrixproteiinia VP24  eiintyi sijoittautuneena sytoplasmisiin inkluusioihin.  Nämä inkluusiot, kappaleet olivat kooltaan suuremiä mitä lähempänä ne sijaitsivat tumaa, muta olivat pienempiä kappaleita mitä lähempänä plasmakalvoa ne sijaitsivat.
Glykoproteiinia GP sijaitsi  sytoplasmassa ja itsenäisesti  muista virusproteiineista riippumatta sitä kulkeutui plasmakalvoon.
Havaitsimme myös, että virusRNA-synteesiä tapahtui inkluusiokappaleiten sisällä. Vastasyntynyttä negatiivista  RNA-säiettä oli sijoittuneena inkluusioiten sisälle, kun taas positiivista  säiteä RNA.ta sijaitsei sekä inkluusioiten sisällä että  ulkopuolella sytoplasmassa. Näistä havaittnoista saa oivallsuta Ebolaviruksen replikaatiosta."

Here, we used a biologically contained Ebola virus system to characterize the spatio-temporal distribution of Ebola virus proteins and RNA during virus replication. We found that viral nucleoprotein (NP), the polymerase cofactor VP35, the major matrix protein VP40, the transcription activator VP30, and the minor matrix protein VP24 were distributed in cytoplasmic inclusions. These inclusions enlarged near the nucleus, became smaller pieces, and subsequently localized near the plasma membrane. GP was distributed in the cytoplasm and transported to the plasma membrane independent of the other viral proteins. We also found that viral RNA synthesis occurred within the inclusions. Newly synthesized negative-sense RNA was distributed inside the inclusions, whereas positive-sense RNA was distributed both inside and outside. These findings provide useful insights into Ebola virus replication.

•  Poimintoja artikkelista:

•  VP 40 sijoittautui useisiin subsellulaarisiin aitioihin. 

VP40 is distributed in multiple subcellular compartments

"Aluksi VP40  proteiinia  havaittiin  6 tuntia infektion alkamisesta nukleoplasmassa.  pistemäisiä VP40 osoittavia signaaleja todenäköisimmintuli niistä viruspartikkeleista  joita oli  jäänyt  liittyneiksi, koska  samanlaisia signaaleja oli havaittu  myös aivan soluista  välittömästi adsorption jälkeen. .Emme havainneet signaalia NP, VP35 tai GP proteiineista välittömästi adsorption jälkeen. mahdollinen syy on sekin, että  näitä molekyylejä on  hyvin matala lukumäärä yksittäisessä virionissa verrattuna siihen määrään, mitä VP40 proteiinia on, sillä se on kaikkein runsain  virusproteiini EBOV viruksessa."

VP40 was initially observed in the nucleoplasm by 6 h.p.i. (see yellow arrow in Fig. 1C, top). The punctate VP40 signals detected at 6 h.p.i. most likely came from viral particles that remained attached (see white arrows in Fig. 1C, top), because similar signals were also observed in cells immediately after adsorption (see white arrows in Fig. 1C, bottom). We did not detect signals for NP, VP35, or GP immediately after adsorption (Fig. 1A, B and D, bottom) probably because of the low number of these molecules in a single virion, compared with VP40 being the most abundant viral protein (Fig. S4).

" Sen jälkeen VP40 asettautui inkluusioihin  NP ja VP35 proteiinien kanssa ja nukleoplasmass sitä  oli 12 tunnin kuluttua infektion alusta."

 VP40 was subsequently distributed in the inclusions, along with NP and VP35, and in the nucleoplasm at 12 h.p.i. (Fig. 2A and B).

"VP 40  jakaantui myös diffuusisti sytoplasman alueelle 18- 24 tunnin aikana infektion alusta. Pieni fraktio VP40 proteiinia havaittiin 18 tunnin kohdalla  selvästä  signaalista plasma kalvolla"

 VP40 was also distributed diffusely in the cytoplasm from 18 to 24 h.p.i. (Fig. 1C). 
A small fraction of VP40 was detected with a distinct signal at the plasma membrane at 18 h.p.i. (see white arrows in Fig. 1C, third panel from the top and Fig. S2B).

"36 tunnin kuluttua  VP40 signaali plasmakalvossa tuli yhä intensiivisemmäksi ja alkoi näyttää  rakenteeltaan fibroosiselta-  36 tunnin kohdalla infektion alusta  VP40 ei vielä  ollut selkeästi lokalisoitunut  pienten inkluusioitten  NP ja  VP35 proteiinien kanssa samaan kohtaan. 
mutta 40 tunnin kohdalla  VP40  oli  plasmakalvossa."

 The VP40 signal at the plasma membrane became more intense and appeared to represent a fibrous structure after 36 h.p.i. VP40 did not clearly co-localize with NP or VP35 in the smaller inclusions found at 36 h.p.i., but was present at the plasma membrane at 48 h.p.i. (Fig. 2A, B, and Fig. S2C).

• Sytoplasmiset inkluusiot:  Näihin asettuu NP, VP35, VP24

NP, VP35, VP30, and VP24 co-localize in cytoplasmic aggregates

" Analysoimme  kuusi niistä seitsemästä  EBOV-geenin koodamasta proteiinista (VP, VP35, VP40, GP, VP30, VP34, L) . L-proteiinin sijoittumsita  emme kuitenkaan voineet  analysoida sopivine anti-L-vasta-aineiten pttumisen takia. Muut analysoitiin  Vero-VP-30 solujen immunofluoresenssi värjäyksestä . Solut oli synkronoidusti infektoitu Ebola deltaVP30:lla. Erilaisten virusproteiinikombinaatioitten stoutuminen tutkittiin myös  immunofluoresensi-kaksoisvärjäyksellä."

 We analyzed the distribution of six of the seven EBOV-encoded proteins (NP, VP35, VP40, GP, VP30, and VP24) by immunofluorescence staining of Vero-VP30 cells that had been synchronously infected with EbolaΔVP30; we were unable to analyze the distribution of the L protein in this assay due to the lack of a suitable anti-L antibody (Fig. 1). The co-localization of various combinations of the viral proteins was also examined by means of immunofluorescence double-staining (Fig. 2). We confirmed synchronous infection by demonstrating a similar staining pattern for NP in multiple-infected cells in the same field (Fig. S1).

" Vahvistimme synkronisen  infektion osoittamalla samanlaisen nukleoproteiinin (NP) värjäytymismallin multippelisti infektoituneista soluista samassa kentässä. NP:n sijoittautuminen havaittiin  pieninä pisteinä sytoplasmasta  6 tuntia infektoimisen jälkeen.Pisteet tulivat isommiksi aggrekaateiksi tuman läheisyydessä 12- 24 tuntia infektion alusta.  Aggrekaatit olivat viruksen  inkluusiokappaleita,  Nämä inkluusioaggrekaatit pienenivät noin  36 tunnin kuluttua . Oli havaittavissa  infektoituneessa solussa 100- 200 aggrekaattia, jotka olivat noin 10 nm läpimitaltaan. pikkuaggrekaatit asettuivat siten  lähelle plasmakalvoa 36- 48 tunnin aikana infektion alusta."

The distribution of NP was observed as small punctate dots in the cytoplasm by 6 hours post-infection (h.p.i.) (Fig. 1A). The dots became large aggregates near the nucleus from 12 to 24 h.p.i. These aggregates were likely viral inclusion bodies. The aggregated inclusions became smaller at approximately 36 h.p.i. Approximately 100–200 aggregates with an average diameter of 10 nm were detected in the infected cells. The small aggregates subsequently distributed near to the plasma membrane from 36 to 48 h.p.i (Fig. S2A). 

 "VP35 proteiinin ilmenemis kinetiikka ja sen jakaantumismalli oli miltei smanlainen kuin nukleoproteiinin (NP), mikä viittaisi siihen, että  sekä NP että VP35  proteiinia oli aggrekaateissa." 

The kinetics of VP35 protein expression and its distribution pattern were almost identical to those of NP, suggesting that both NP and VP35 were present in the aggregates (Fig. 1B).

" Koska  EboladeltaVP30  on vailla VP30 geeniä,  on  virustranskriptioon lisättävä  exogeenisesti ilmennettyä   VP30 proteiinia.  VP30 jakaantui sytoplasmaan pistemäisenä infektoitumattomissa soluissa. , kun taas  Ebola deltaVP30 infektoiduissa soluissa VP30  inkorporoitui  inkluusioihin sijaiten tällöin  samassa kuin NP koko infektion ajan."
.
Because EbolaΔVP30 lacks the VP30 gene, exogenously expressed VP30 is supplied for viral transcription³⁰. VP30 was distributed in the cytoplasm as punctate dots in uninfected cells (Fig. 1E, bottom), whereas in EbolaΔVP30-infected cells, VP30 was incorporated into the inclusions, co-localizing with NP throughout the infection (Fig. 2D).

" VP24-proteiinia havaittiin sytoplasman inkluusioissa 18 tunnin kohdalla infektion alusta, jolloin suurin osa siitä asettautui samaan kuin NP. Kuitenkaan varhaisissa vaiheissa viruksen replikaatiosyklissä VP24 ei lokalisoidu samaan kuin NP:"

 VP24 protein was detected in the cytoplasmic inclusions at 18 h.p.i. and onward (Fig. 1F), where most of it co-localized with NP (Fig. 2E). However, at the early time points in the viral replication cycle, VP24 did not co-localized with NP.

• Viruksen glykoproteiini(GP) sijoittautui erilleen muista virusproteiineista kunnes se oli liikennöity plasmakalvoon. 

GP is distributed in the cytoplasm separately from the other viral proteins until it traffics to the plasma membrane

" Glykoproteiinin (GP)  antama signaali havaittiin sytoplsmasta   6 tunnin kohdalla  infektion alkamisen jälkeen. Perinukleaarisessa eli  tuman vierialueessa  sitä oli 12 - 36 tunnin kuluttua infektion alusta.  GP  jakantui täplämäiseti perinukleaarisessa alueessa ja sen jälkeen sitä alkoi sijoittautua  kautta sytoplasman,  poispäin inkluusioista ,   VP40 proteiinin läheisyyteen. Mutta päinvastoin kuin VP40 suhten, GP ilmeni  plasmakalvolla vasta  virionin kokoontumisen myöhäisessä vaiheessa. Kun 48 tuntia oli täynnä,  GP proteiinit  esiintyivät plasmakalvolla laajamittaisesti yhdessä VP40 matrixproteiinin kanssa."

The GP signal was detected in the cytoplasm at 6 h.p.i. and in the perinuclear region from 12 to 36 h.p.i. (see white arrows in Fig. 1D). GP was distributed in a speckled pattern in the perinuclear region; it was subsequently distributed throughout the cytoplasm, away from the inclusions, or near the cytoplasmic VP40 (Fig. 2C). Unlike VP40, GP was not detected at the plasma membrane until a late stage of virus assembly (Fig. 1D and Fig. S2D). GP was extensively co-localized with VP40 at the plasma membrane at 48 h.p.i. (Fig. 2C).

•  Entä viruksen geenikoodi vRNA?  Viruksen RNA syntetisoituu sytoplasmassa  Ebola deltaVP30-infektoiduissa soluissa.

Viral RNA is synthesized in the cytoplasm of EbolaΔVP30-infected cells

" Arvellaan, että infektoituneissa soluissa  EBOV RNA replikoituu ja transkrptoituu  sytoplasmassa itsenäiseeti, riippumatta solun RNA-synteisstä tumassa. Testasimme tätä hypoteesia in situ merkkamalla  replikoitunutta ja transkriptoitunutta vRNA.ta käyttämällä BrUTP:ta. Transfektoimme  BrUTP Ebola deltaVP30:llä infektoituihin soluihin 24 tuntia infektion alusta ja inkuboimme  soluja kaksi tuntia. merkatun RNA.n jakautuma ja VP40 analysoitiin immunofluoresenssikaksoisvärjäyksen avulla. BrUTP:lla merkattu RNA havittiin inkluusioista ja inkubaation jälkeen sitä siaitsi   VP40:n kanssa  samassa kohtaa plasmakalvossa."

The replication and transcription of EBOV RNA is thought to take place in the cytoplasm of infected cells independently of cellular RNA synthesis in the nucleus³¹. We tested this concept by in situ labeling of replicated and transcribed viral RNA by using BrUTP. 
We transfected BrUTP into EbolaΔVP30-infected cells at 24 h.p.i., and incubated the cells for 2 h for chasing. The distribution of BrUTP-labeled RNA and VP40 were analyzed by means of immunofluorescence double-staining. BrUTP-labeled RNA was detected in the inclusions (Fig. 3A) and, after chasing for 12 h, it was found co-localized with VP40 at the plasma membrane (Fig. 3B).

•  Vastasyntetisoituneen  viraalin RNA:n sijoittuminen Ebola deltaVP30-infektoiduissa soluissa

The distributions of newly synthesized viral RNA in EbolaΔVP30-infected cells

 "EBOV virioneista vapautuvia vRNA genmeja transkriboituu  seitsemäksi monokistroniseksi mRNA:ksi, joista tuottuu virusporoteiineja.
vRNA genomin  replikaatiosta  syntyy replikaatiovälituotetta,  positiivista antigenomia +RNA, joka on täydellinen kopio negatiivisesta vRNA:sta. Antigenomi RNA puolestaan toimii templaattina uusien virionien genomin tuotossa. Analysoimme vasta syntetisoituneen positiivisen (+sense) ja negatiivisen (-sense) virusRNA:n sijoittautumista  käyttämällä fluoresenssi in situ hybridisaatiota( FISH).  Generoimme fluoresoivasti merkatun  sense ja antisense-luotaimen NP RNA:lle, joka salli meidän erottaa negatiivisen  ja positiivisen EBOV-RNA:n Sitten me analysoimme  NP:n ja vRNA:N  samaan paikkaan asettumisen käyttäällä  kombinaationa FISH-menetelmää  ja  immunofluoresenssivärjäystä"


The viral RNA genome released from EBOV virions is transcribed into seven mono-cistronic mRNAs to produce viral proteins^{32, 33}. Replication of the viral RNA genome results in the synthesis of a replicative intermediate, the positive-sense anti-genome, which is a complete copy of the negative-sense viral genome. This anti-genomic RNA in turn serves as a template for the generation of progeny viral genomes. We analyzed the distribution of newly synthesized positive- and negative-sense viral RNA by using fluorescence in situ hybridization (FISH). We generated fluorescently labeled-specific sense and antisense probes for NP RNA, which allowed us to distinguish between negative- and positive-sense EBOV RNA. We then analyzed the co-localization of the viral RNA and NP by using a combination of FISH and immunofluorescence staining. 

"( -)ssRNA , joka todennäköisesti  edusti vastasyntetisoitunutta  virusgenomia (vRNA) oli asettunut 6 tunnin kohdalla inkluusioihin. (-)ssRNA signaalit  asettuivat  samaan kohtaan kuin NP-proteiinit inkluusioissa 12 tunnin kohdalla suuressa määrin ja  vähemmässä määrin plasmakalvolla 48 tunnin kuluttua.
Antisense luotain- jota käytettiin tässä tutkimuksessa, ei pystynyt tekemään eroa .viruksen mRNA:n  ja  antigenomiRNA:n kesken. ( molemmat ovat (+)ssRNA muotoa)
Positiivisen RNA:n signaali havaittiin  aluksi inkluusioissa  6 - 12 tunnin aikana ja fdiffuusisti sytoplasmassa  18 tunnin kuluessa, eikä sitä ollut havaittavissa enää 48 tunnin päästä."

Negative-sense RNA, which likely represented the newly synthesized viral genome, was co-localized with the inclusions at 6 h.p.i. (Fig. 4). The negative-sense RNA signals co-localized with the NP protein in the inclusions at 12 h.p.i. extensively, and to a lesser extent at the plasma membrane at 48 h.p.i (Fig. S3). The antisense probe used in this study could not distinguish between viral mRNA and anti-genomic RNA. The positive-sense RNA signal was initially detected in the inclusions from 6 to 12 h.p.i., in the cytoplasm diffusely at 18 h.p.i, and was undetectable at 48 h.p.i (Fig. 5).