3. Retroviraalinen TRIM5α järjestelmä
3.1. Intrasellulaarista immuniteettia on muutakin kuin Fv1
Fv1 ei ole ainoa geneettinen järjestelmä, mikä suo intrasellulaarista immuniteettia retroviraalista infektiota kohtaan. Esimerkiksi N-trooppisen MLV-viruksen replikaatio ja EIAV -lentiviruksen (hevosen infektiöösin anemiaviruksen) replikaatio on inhiboitunut ihmissoluissa. Samoin nisäkkään lentiviruksista HIV-1:n ja rhesusapinan SIVmac-viruksen replikaatiot ovat estyneet eri apinalajien soluissa. ESIM. HIV-1 ei pysty kasvamaan vanhan maailman apinain soluissa ja näihin kuuluvat African green monkeys (agm)ja Rhesus macaques-apinalajit (mac). SIVmac ei taas pysty infektoimaan uuden maailman apinoita, joihin kuuluu squirrel monkey, orava-apinat ja common marmoset, kynsiapinat.
3.1. Fv1 is not the only genetic system conferring intracellular immunity against a retroviral infection. For example, the replication of N-tropic MLV and the equine infectious anemia virus (EIAV, a lentivirus) is also inhibited in human cells, as is that of the primate lentiviruses HIV-1 and SIV from rhesus macaques (SIVmac) in cells from different monkeys. For example, HIV-1 does not grow in old world monkeys, which include African green monkeys and rhesus macaques, and SIVmac does not infect new world monkeys, which include squirrel monkeys and common marmosets.
3.2. Miten Lv1 ja Ref 1 blokeeraukset muistuttavat Fv1-restriktiota?
Ensinnäkin: Viruksen replikaatio epäonnistuu käänteiskopiointikohdilta.
Toiseksi, CA kapsidiproteiini on myös kohteena (target). Kapsidiproteinin CA aseman 110 aminohappo myös määrää N-trooppisen MLV:n restriktion ihmissolussa. HIV-1 viruksen restriktio rhesus macaque -apinan solussa kumoutuu, jos sen CA ( kapsidiproteiini) korvataan SIVmac CA-proteiinilla.
Kolmanneksi: Koska inhibitiota non-restriktiivisen ja restriktiivisen solun välillä ylläpitää heterokaryon, tämä restriktio on dominantti.
Lopuksi: Nämä blokit ovat saturoitavissa.
Kuitenkin koska mitään Fv1-geeniin verrattavaa geeniä ei löydy nisäkässoluista, ihmissoluissa tapahtuva blokeerautumisen N-trooppiselle MLVvirukselle ja EIAV lentivirukselle on oletettu johtuvan restriktiofaktorista 1 (Ref 1) ja apinansoluissa esiintyvä blokeerautuminen HIV-1 ja SIV-1 viruksille katsotaan johtuvan lentivirukselle alttiusfaktorista Lv1 ( lentivirus susceptibility factor 1)
3.2. Interestingly, these blocks resemble Fv1 restriction in several ways. First, viral replication is impaired at the step of reverse transcription . Second, CA is also targeted. The residue at position 110 in CA also determines the restriction of N-tropic MLV in human cells and that of HIV-1 in rhesus macaque cells is abrogated when its CA is replaced by that from SIVmac.
Third, because heterokaryons between non-restrictive and restrictive cells maintain the inhibition, this restriction is dominant. Finally, these blocks are saturable. However, since no Fv1-related gene could be found in primate cells, blocks to N-tropic MLV and EIAV in human cells were thought to be due to the restriction factor 1 (Ref1), and those to HIV-1 and SIV in monkey cells to the lentivirus susceptibility factor 1 (Lv1).
3.3. TRIM5alfa geeni. Mitokondriaalinen integriteetti tärkeä.
Todellakin Ref1 ja Lv1 näyttivät omaavan toisiaan lisääviä samankaltaisuuksia blokeeratessaan retroviraalisia replikaatioita. Esimerkiksi molemmat restriktiot poistuvat, jos mitokondriaalisten kalvojen integriteetti särkyi kemiallisesti. Nämä ovat myös saturoitavissa samoilla virusten kaltaisilla partikkeleilla.
Kun käytettiin funktionaalista komplementtimenetelmää, Lv1 identifioitiin ensiksi rhesus macaque -apinan TRIM5alfa geeninä (macTRIM5alfa). Myöhemmin kun eliminoitiin TRIM5alfa transkripteja vanhan maailman apina-ja ihmissoluista siRNA interferenssillä, katosi samalla Lv1 ja Ref1 blokeeraukset. Tutkimukset osoittivat, että hTRIM5 alfa, macTRIM5alfa ja agmTRIM5alfa ( African green monkey) pystyvät tekemään sellaisen restriktion eri viruksille, mitä aiemmin oli katsottu Lv1 ja Ref1 funktioiksi. Niinpä Lv1 ja Ref 1 on katsottava lajispesifisiksi TRIM5alfa varianteiksi.
3.3. Indeed, Ref1 and Lv1 share additional similarities in blocking retroviral replication. For examples, both restrictions can be attenuated by chemicals that disrupt the integrity of mitochondrial membranes, and they can be saturated by the same virus like particles (VLPs). Using a functional complementation assay, Lv1 was first identified as the rhesus macaque TRIM5α (macTRIM5α) gene. Later, by eliminating TRIM5α transcripts from old world monkey and human cells with small interfering RNA (siRNA), the Lv1 and Ref1 blocks were also abrogated. Further studies revealed that hTRIM5α (from humans), macTRIM5α and agmTRIM5α (from African green monkeys) restrict the replication of different viruses, which were assigned previously to Lv1 and Ref1 .Thus, Ref1 and Lv1 are species-specific variants of TRIM5α.
3.4. Ihmisen hTRIM5alfa proteiini, TRIM5 geenit. RBCC rakenne
Ihmisen TRIM5alfa proteiinissa on 493 aminohappotähdettä ja se kuuluu suureen tripartiittimotiiviperheeseen, jossa on 37 geeniä. Niihinluetaan PML tai TRIM19 geeni ( promyelosyyttileukemiaproteiini). Kun ne käyttävät vaihtoehtoista RNA-pilkkoutumista ne voivat tuottaa 71 eri transkriptia. Esimerkiksi ihmisen TRIM5 geeniä hTRIM5α, β, γ, σ, ε, ja ζ..
Vaikka niitten funktiosta on vain vähän tietoa, tiedetään että niillä on rakenteessaan kolme selvää motiivia
- RING Zn++finger,
- yksi tai kaksi kappaletta B-box Zn++finger
- yksi alfa-helix-hair pin (CC, coiled coil) alue.
Tämän takia niitä kutsutaan myös nimellä: RING finger: B box: -Coiled Coil (RBCC) family proteins. Tämä RINGfingermotiivi sisältää cysteiiniä runsaasti ja siihen kuuluu kaksi toisiaan vastaan välilehtimäisesti sijaitsevaa sinkkiä sitovaa kohtaa. Monet RING-finger proteiineista toimivat kuten E3 ubikitiiniligaasi ja niillä on avainosuutta proteiinien hajoittamisessa (silppuroimisessa).
ESIM: Ring-box-1 (Rbx1) on essentielli komponentti sellaisessa kompleksissa, jonka nimi on SCF ( Skp1:cullin-1:F-box).
Lisäksi TRIM5σ osoittaa E3 ligaasin aktiivisuutta koeputkessa.
3.4. The hTRIM5α protein contains 493 residues and belongs to the large tripartite motif (TRIM) family that consists of 37 genes, which include the promyelocytic leukemia (PML or TRIM19) protein. By alternative RNA splicing, they produce 71 different transcripts. For example, the human TRIM5 gene is expressed as hTRIM5α, β, γ, σ, ε, and ζ. Although little is known of their function, they contain three distinctive structural motifs, a RING Zn++ finger, one or two B-box Zn++ finger, and an α-helical coiled-coil (CC) region. For this reason, they are also called the RING finger:B box:Coiled-coil (RBCC) family proteins. The RING finger motif features a cysteine-rich consensus, which contains two interleaved Zn++-binding sites. Many RING finger proteins act as E3 ubiquitin ligases and play key roles in protein degradation. For example, Ring-box-1 (Rbx1) is an essential component of the Skp1:cullin-1:F-box (SCF) complex. Additionally, TRIM5σ displays E3 ligase activity in vitro.
3.5. TRIM-proteiinien sijainti solussa. B-Boxit. TRIM19 (PML). SPRY.
B-boxit, joissa on yksi Zn++ sitova kohta ja B1 ja B2 motiivit, orientoivat hairpin (CC) motiivia, joka välittää proteiini-proteiini-interaktioita.
Itseasiassa TRIM proteiinit muodostavat oligomeereja.
Lisäksi TRIM 5alfa sisältää SPRY domaanin C-terminaalissaan. Tämä domaani identifioitiin ensiksi sp1A- kinaasina Dictyosteliumista ja kaniinin ryanodiinireseptorista ja se kuuluu B30.2 alaluokkaan tai RFP-kaltaiseen domaaniin. Butyrofiliinissa B30:2 domaani, jossa on 170 tähdettä, osallistuu ligandin sitomiseen.
TRIM-proteiinit lokalisoituvat erityisiin soluaitioihin, joissa ne muodostavat erillisiä rakenteita. Kun TRIM19 kertyy erillisiin PML-onkogeenisiin domaaneihin (PODs) tumassa, niin TRIM5alfa voi muodostaa sytoplasmisia rakenteita ( cytoplasmic bodies).
3.5. SITAATTI. B-boxes, which consist of one Zn++-binding site and a B1 or B2 motif, orient the CC motif that mediates protein-protein interactions. Indeed, TRIM proteins form oligomers.In addition, TRIM5α contains a SPRY domain at its C-terminus. The SPRY domain was originally identified in the splA kinase of Dictyostelium and the rabbit ryanodine receptor, and belongs to the subclass of the B30.2 or RFP-like domains. In butyrophilin, the B30.2 domain, which contains 170 residues, is involved in ligand binding. Of interest, TRIM proteins localize to particular cellular compartments where they form discrete structures. Whereas TRIM19 assembles discrete PML oncogenic domains (PODs) in the nucleus, TRIM5α can form cytoplasmic bodies.
3.6. Ihmisille vaikea mutaatio tapahtunut V1/SPRY R332P
Vaikka TRIM proteiineilla on 87 % sekvenssisamankaltaisuus, niin vain macTRIM5alfa pystyy blokeeraamaan mutta hTRIM5alfa ei pysty blokeeraamaan HIV-1 replikaatiota.
Tämä lajispesifinen restriktio kartoitettiin SPRY-domaaniin. Geneettisesti analysoiden saatiin selville, että SPRY-domaani on dramaattisesti mutatoitunut nisäkkäitten evoluution aikana ja sisältää neljä variaabeli aluetta V1, V2, V3 ja V4.
Yhden yksittäisen aminohapon muutos (R332P, arginiini proliiniksi) variaabelissa V1 kumoaa HIV-1 viruksen replikaatiota estävän vaikutuksen ihmisen hTRIM5alfasta. Tästä voidaan päätellä, että SPRY-domaani pystyy vaikuttamaan kapsidiproteiiniin (CA)kohdistumisen. Vaikka ei ole demonstroitu sitoutumista rhesus apinan rhTRIM5alfa SPRY-domaanin ja HIV-1 CA kapsidiproteiinin välillä, kuitenkin pöllöapinalta ( owl monkey) tehdyt löydöt omTRIM5alfan suhteen antavat näyttöä sellaiseen suoraan interaktion olemassaolosta . Nyt seuraa aika monimutkainen kertomus selitykseksi.
3.6. Although they share 87 % sequence similarity, only macTRIM5α but not hTRIM5α blocks HIV-1 replication. This species-specific restriction was mapped to the SPRY domain. Through genetic analysis, it was revealed that this SPRY domain has experienced dramatic mutations during primate evolution and contains four variable regions V1, V2, V3, and V4. The change of a single residue (R332P) in V1 abolished the inhibition of HIV-1 replication by hTRIM5α , which suggests that the SPRY domain is responsible for its targeting of CA. Although no binding between the SPRY of rhTRIM5α and HIV-1 CA has been demonstrated, the findings with TRIM5α from owl monkeys (omTRIM5α) support such direct interactions.A rather complicated story follows.
3.7. Kertomus Cyclophilinin osuudesta ja johtopäätöksistä
Cyclofiliini A (CypA) on eukaryoottinen peptidyyliprolyyli cis-trans-isomeraasi. Se sitoutuu proliinirikkaaseen ulokkeiseen silmukkaan HIV-1 viruksen kapsidiproteiinissa (CA) ja se on kriittinen viruksen replikaatiolle ihmisen soluissa. Mutta pöllöapinan soluissa asia on päinvastoin: kyky sitoutua CypA-molekyyliin on restriktio , estävä tekijä HIV-1 viruksen replikaatiolle.
Pöllöapinat ovat atyyppisiä uuden maailman apinoita, koska niitten (salliva tekijä) Lv1 estää HIV-1, mutta ei estä SIVmac virusta. Vaikkakin tämä pöllöapinan blokki HIV-1 replikaatiolle kumoutuu, kun interaktio CA-kapsidiproteiinin ja syklofiliinin CypA kesken estetään CA-mutaatiolla tai syklosporiini A-käsittelyllä , niin sama manipulaatio ihmissolussa taas lisää (estävän tekijän) Ref1 efektiä HIV-1 virukseen .
Selitykset näihin eroihin saatiin, kun kloonattiin pöllöapinan omTRIM5alfa geeniä.
Sen SPRY-domaanin sijasta se sisältää täydellisen CypA-geenin. Täten pöllöapinan solut ilmentävät fuusioproteiinia omTRIM5alfan ja CypA:n kesken (omTRIM5alfaCypA), mikä todennäköisimmin saa alkunsa CypA geenin retrotranspositiosta omTRIM5alfan lokukseen pitkällä sekaansirottautuneella tumaelementti-1:llä ( LINE-1 tai LI). Johtopäätöksenä on, että CA ja omTRIM5alfa ovat keskinäisessä vuorovaikutuksessa tämän CypA-domaanin välityksellä ja aiheuttavat restriktiota HIV-1 replikaatiolle pöllöapinoissa.
(CypA) is an eukaryotic peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase. It binds an exposed proline-rich loop in CA of HIV-1 and is critical for its replication in human cells. In contrast, the ability to bind CypA restricts HIV-1 replication in owl monkey cells.
Owl monkeys (om) are atypical new world monkeys because their Lv1 inhibits HIV-1 but not SIVmac. Although this block to HIV-1 replication is abrogated when the interaction between CA and CypA is prevented by mutations in CA or by cyclosporin A treatment in owl monkey cells, the same manipulations increase effects of Ref1 on HIV-1 in human cells.
The explanation for these differences came with the cloning of the omTRIM5α gene.
Instead of the SPRY domain, it contains the complete CypA gene. Thus, owl monkey cells express a fusion protein between omTRIM5α and CypA (omTRIM5α.Cyp), which most likely arose from a retrotransposition of the CypA gene into the omTRIM5α locus by the long interspersed nuclear elements-1 (LINE-1 or L1). In conclusion, CA and omTRIM5α interact via this CypA domain and restrict HIV-1 replication in owl monkeys.
3.8. Antiviraalit vaikutukset kohdistuvat viruksen ydinkoteloon (CA) tai tumaan kuljetukseen ( Nuclear entry)
Näistä tutkimuksista voisi olettaa, että Fv1 ja TRIM5alfa voisivat suoraan olla interaktiossa ydinkapsidiproteiiniin CA ja täten blokeerata soluun sisääntulevia viruksia. Kuitenkin, päinvastoin kuin Fv1, joka blokeeraa tumaan menoa ja proviruksen integraatiota, TRIM5alfa estää viruksen replikaatiota vaiheessa, joka on juuri ennen käänteiskopioimista.
On hämmästyttävää, miksi tällaisia eroja esiintyy. Vastauksen ehkä havaitsee siitä, että MLV pidättää CA-proteiinia liittyneenä käänteiskopiokompleksiinsa, mutta sitä ei tee HIV-1. Joten HIV-1:n vaipankuoriutuminen ( uncouting) saattaisi tapahtua nopeammin kuin MLV-viruksella. Heti kun ydinkotelon (core) rakenne on tuhoutunut, voisi käänteiskopiokompleksi (RTC) tulla alttiimmaksi TRIM5alfa vaikutukselle. TRIM5alfa voisi silloin triggeröidä esiin PIC-kompleksin menon proteiinisilppuriin.
Tämä malli myös tarjoaa selitystä siihen, miksi viruksen replikaatio lisääntyy, kun kohdesoluja käsitellään proteosomaalisilla inhibiittoreilla.
Edelleen tarvittaisiin lisätutkimuksia muista proteiineista, jotka ovat interaktiossa Fv1:n ja TRIM5alfan kanssa, niitten entsymaattisista ominaisuuksista ja niitten kulkeutumisista soluissa.
3.8. These studies suggest that Fv1 and TRIM5α might interact directly with CA to block incoming viruses. However, in contrast to Fv1, which blocks nuclear entry and integration of the provirus, TRIM5α inhibits viral replication at a step before reverse transcription.
It is puzzling why such differences exist. An answer might lie in the observation that MLV, but not HIV-1, retains its CA in the reverse transcription complex. Thus, the uncoating of HIV-1 could proceed much faster than that of MLV. Once the core structure is destroyed, the reverse transcription complex could become more susceptible to TRIM5α. TRIM5α could then trigger the proteasomal degradation of PIC.
This model also offers an explanation of the enhancement of viral replication when target cells are treated with proteasomal inhibitors.
Further details await studies of other proteins that interact with Fv1 and TRIM5α, their enzymatic properties and trafficking in cells.
Inga kommentarer:
Skicka en kommentar