Vpu, HIV-1

Silmäys HIV-1 viruksen vpu proteiiniin.Minulla on lainakirja josta suomenna muutaman asian:
Lähde: Paule Spearman, Eric O.Freed. Hiv Interactions with Host Cell proteins.
ISBN 978- 3- 642- 02174- 9

HIV-1 viruksen proteiini U eli Vpu koodautuu HIV-virusgenomin yhdestä lisägeenistä, joita on useita. Näitten lisägeenien tuotteina on proteiinit Vif, Vpr ja Vpu.

Vpu proteiinin tehtävänä on kohdistaa puolestaan isäntäkehon CD4 silppuroitavaksi, kuten Vif kohdisti APOVBEC tekijät silppuriin.
http://groups.molbiosci.northwestern.edu/matouschek/images/sequential.gif http://groups.molbiosci.northwestern.edu/matouschek/images/sequential.gif /a

• Miten Vpu tässä toimii?

Vpu ( kuten Vif ja Vpr) rekrytoi solun ligaasien multi-yksikön. Lisäksi se tekee jonikanavia solukalvoon. Näin Vpu vastustaa näillä keinoilla niitä isäntäsolun tekijöitä, jotka rajoittavat uuden virionisukupolven vapautumista isäntäsolusta.

• Vpu proteiinin pääkohde on tetheriini
  

Solussa on tetheriiniä, interferonin indusoimaa transmembraanista proteiinia BST-2 /CD317. joka voi rajoittaa viruksen replikoitumista pidättämällä vastamuodostuneita virioneita solun pinnssa. Vastavaikuttamalla tähän isäntäkehon puolustuksen kohtaan Vpu voi antagonisoida luonnollisen immuunipuolustuksen vasteita viruksiin.

• Mitkä virukset omaavat Vpu tekijän?

Lähinnä HIV-1 virustyyppi koodaa Vpu tekijää, vaikka sitä on havaittu myös eräässä SIV alaryhmässäkin simpanssien immuunivajeviruksessa, mitä arvellaan nykyisen ihmiskunnassa riehuvan pandemisen viruksen edeltäjäksi. Siis HIV on "simpassivirus pandemia", jos sanotaan analogisesti sikainfluenssan tai lintuinfluenssan tapaan. Useimmilta SIV kannoilta puuttuu kuitenkin Vpu tekijä ja samoin HIV-2 tyyppiseltä ihmisten pandemiselta immuunivajevirukseltakin. Joissain HIV-2 tyypin viruksissa tuottuu sen sijaan kalvoproteiinia Env (envelope protein), joka tekee samaa virkaa ja avustaa uusien virioitten ulospääsyä infektoituneista soluista.

• Missä vaiheessa vpu geeni translatoituu vastaavaksi proteiiniksi?

mRNA, joka tuottaa vpu tekijää on bicistroninen ja ilmentää myös kalvoproteiinia Env ( envelope glykoprotein), mistä voisi päätellä että ettää Vpu ja Env geeneillä on kaukainen geneettinen, funktionaalinen sukulaisuus (1990). Nämä mRNA:t ovat ovat epätäydelliseti pleissautuneet (spliced), epätäydellisetsi yhteenliitettyjä ja vaativat viruksen Rev proteiinia tumasta sytoplasmaan kuljetukseen ja translaatioon. Tästä johtuen Vpu ja Env ilmenevät suhteellisen myöhään viruksen replikaatiosyklin kuluessa ( late viral gene products) .

• Mihin Vpu proteiini ihmisen soluissa asettuu?

Vpu on transmembraaninen ja kertyy erilaisiin kalvosysteemeihin, kuten endoplasmiseen verkostoon (ER), Golgin laitteeseen, trans-Golgin järjestelmään ja endosomeihin, myös niihin endosomeihin, jotka suorittavat endosytoitujen proteiinien ( solun otettujen valkuaisaineitten) endosomaalista kierrätystä ( recycling) plasmakalvoon - tämä on solun tärkeä "työjuhtajärjestelmä", jonka virus takavarikoi sälyttäen siihen omat virionsa solusta ulos kuljetusta varten.
Muuan Vpu tyyppi ( HIV-1, group M, clade C) näyttää sijaitsevan ainakin osittain plasmamembraanisssa. Vpu liikkumisia sytoplasmassa kontrolloi aiankin ositain sen sytoplasmiset domaanit. Arvellaan että Vpu ei menisi sisälle uusiin virioihin. Siis virioneissa olisi vain sen geeni, joka tuottaisi sitä myöhäisessä vaiheessa vasta tarpeeseen.

• Minkälainen Vpu on rakenteeltaan?

Koko on 16 kDa ja se on miltei kokonaan ilman kalvon luminaaliselle puolelle ulottuvaa domaania; se on yksinkertainen kalvoproteiini, jonka sytoplasminen osa asettuu vuorovaikutukseen useitten soluproteiinien kanssa. Eräästä Vpu:sta todettiin 81 aminohappoa, vain 4-5 luminaalista, 23 kalvonsisäistä ja loput sytoplasmisia. Jos proteiini multimerisoituu, muodostuu selektiivisiä jonikanavia monovalenteille kationeille (+). Solulimassa oleva osa rekrytoi soluproteiinia beeta-TrCP, joka on SCF-E3 ubikitiiniligaasin substraattiadaptorikompleksi seriinifosforylaatiosta riippuvalla tavalla (1998)
Transmembraaninen jakso (TMD): on alfa-helixrakenteinen. Helixin tyvessä on tryptofaani, joka ankkuroinee jaksoa plasmakalvon sytoplasmiseen lehteen vuorovaikuttamalla fosfolipidryhmiin. TMD-oligomeerit lipidikerrosten sisällä tekevät mahdollseksi jonikanavana toimimisen.

Sytoplasmisella puolella Vpu sisältää alfahelixin silmukoita. Hyvin konservatiivinen on Vpu jakso DSGXXS, jonka kautta se vaikuttaa soluproteiiniin beeta- TrCP ja sillä tavalla linkkii HIV-1 virukselle epämiellyttäviä solurakenteita kuten CD4 ubikitinylaation kautta kohti proteiinisilppuria. Tälle vaikutukselle on välttämätöntä, että seriini (S) fosforyloituu DSGXXS sekvenssissä.

Vpu:n sytoplasminen domaani tekee myös suoran interaktion solun CD4 kanssa. Tämä CD4 on solun puolustusjärjestelmän virusreseptori, se havaitsee viruksen. Ternaarinen kompleksi ( CD4, Vpu ja Beeta-TrCP sitten tehokkaasti aiheuttaa CD4:n silppuroitumisen ( katoamisen).

CD4+ tilannetta pahentaa vielä Nef, joka on HIV-1 viruksen lisäproteiini. Nef vaikuttaa (päinvastoin kuin Vpu) jo virusreplikaation varhaisessa vaiheessa ja suoraan irrottaa CD4 molekyylejä plasmakalvon pinnasta aiheuttaen niitten endosytoosia ja endolysosomaalista hajoamista. Viruksen kannalta CD4 puolustusmolekyylin vaimennussäätö on moninkertaisesti tärkeä seikka ja estää myös superinfektion, siis jo infektoitunut solu ei voi toista kertaa infektoitua, samalla virioneitten vapautuminen lisääntyy. Myös estyy, ettei CD molekyyliä pakkaudu mukaan uusiin viruksiin. Nimittäin virukseen liittyneenä CD voisi estää infektiivisyyden vaikuttamalla viruskalvon glykoproteiiniin (viral envelope glykoprotein).
Lisäksi Vpu voi kohdistaa CD4 molekyylin endoplasmiseen retikulumiin kiihdyttäen sen prosesoimista soluproteaaseilla gp41 ja gp120:een, joita viruksen infektiivisyyteen tarvitaan.

• Enemmän tietoa solun restriktiivisestä tekijästä, BST-2/CD317

Tämä tekijä estää retrovirusperäisten partikkeleitten (virion) vapautumista infektoituneista soluista ja tätä tekijää vastaan vaikuttaa viruksen taholta Vpu.
Tämä suhde selvittää Vpu:n pitkäaikaisen toimintamahdollisuuden virioneitten vapautumisen avustamisessa.
BST-2 on myös transmembraaninen kuten CD4.
Vpu tarvitsee tämän molekyylin pyydystämiseksi seriinit 52 ja 56 sytoplasmisessa domaanissaan ja niitten avulla se linkkiää tämän proteiinin silppuritiehen beeta-TrCP/ SCF-ubikitiiniligaasien kompleksin avulla (2008).
Mutta vaikka proteosomi olisi estetty, BST-2 säätyisi kuitenkin vaimeaksi Vpu-vaikutuksesta. Tästä voisi päätellä, että jos ubikitinaatiota on kuitenkin, siitä liipaistuisi esiin endolysosomaalinen proteiinin hajoittaminen pikemminkin kuin proteosomissa silppuroiminen ( 2008) .

• Miksi Vpu itse ei hajoa?

Vaikka Vpu rekrytoi beeta-TrCP/SCF E3 kompleksin, se ei itse hajoa tämän kautta. Siitä voi päätellä että se toimii eräänlaisena valhesubstraattina kompleksille ja se voi myös kyllästää kompleksin, mikä kompetitiivisesti estää fysiologisia solusubstraatteja hajoittumasta. Tämä stabilisoi joitain spesifisiä proteiineja ja vaikuttaan iiden säätelyjen alaisiin soluprosesseihin vikatoimintaa. Kaksi mainittavinta vaikutusta tästä on viruksen Vpu proteiinin vaikutus Ikbeetaan ja beeta-kateniinin (2001).

• Jonikanava-aktiivisuus

Vpu on kutsuttu jopa viroporiiniksi, sellaiseksi virusten koodaamaksi transmembraaniseksi proteiiniksi kuten influenssa A viruksen M2, hepatiitti C-viruksen p7 proteiini ja Sindbis viruksen 6K proteiini. Kuitenkin Vpu:n jonikanavat ovat nopeasti haihtuvia ja niitä luonnehtii Vpu-oligomeerien liittymiset (assosiaatiot) ja irtoamiset (dissosiaatiot) toisistaan. Molekulaarisilla malleilla tutkien vaikuttaa kanavat olevan pentameeristä tai mahdollisesti hexameeristä transmembraanisten monomeerien assosioitumista (2002).

Vpu vaatii aivan korrektin aminohappojärjestyksen transmembraanisen domaanin TMD kohtaan voidaakseen kiihdyttää virioneitten vapautumista, mutta CD4:n hajoittamiseen kelpaa vähäisempikin korrektiivisuus. Jonikanava-aktiivisuus on mekanistisesti suhteessa virionien vapauttamisen kiihtymiseen. Tätä mallia tukee havainto jonikanavia blokeeravasta vaikutuksesta ( hexametyleeniamiloridilla): Vpu:n aiheuttamat sekä transmembraaninen johtuvuus että virionien vapautumisen kiihdytys estyi.

Lisäksi, jos tietellisissä kokeissa korvattiin histidiinillä (H18) Alaniini Ala(18) Vpu:n TMD jaksossa (jolloin jakso muistutti A influenssaviruksen M2:n TMD jaksoa), niin HIV-1 viruksen vapautuminen tulee herkäksi adamantaaneille amantadiinille ja rimantadiinille,in. Siksi sitä on luokiteltu jopa viroporiiniksi, sellaiseksi virusten koodaamaksi transmembraaniseksi proteiiniksi kuten influenssa A viruksen M2, hepatiitti C-viruksen p7 proteiini ja Sindbis viruksen 6K proteiini. Kuitenkin Vpu:n jonikanavat ovat nopeasti haihtuvia ja niitä luonnehtii Vpu oligomeerien liittymiset (assosiaatiot) ja irtoamiset ( dissosiaatiot) toisistaan. Molekulaarisilla malleilla tutkien vaikuttaa kanavat olevan pentameeristä tai mahdollisesti hexameeristä transmembraanisten monomeerien assosioitumista (2002).

Vpu vaatii aivan korrektin aminohappojärjestyksen TMD kohtaan voidaakseen kiihdyttää virioneitten vapautumista, mutta CD4:n hajoittamiseen kelpaa vähäisempikin korrektiivisuus. Jonikanava-aktiivisuus on mekanistisesti suhteessa virionien vapauttamisen kiihtymiseen. Tätä mallia tukee havainto jonikanavia blokeeravasta vaikutukseta ( hexametyleeniamiloridilla): Vpu:n aiheuttama sekä transmembraaninen johtuvuus että virionien vapautumisen kiihdytys estyi.

Lisäksi, jos tieteellisissä kokeissa korvattiin histidiinillä(H18) Alaniini Ala(18) Vpu:n TMD jaksossa (jolloin jakso muistutti A influenssaviruksen M2:n TMD jaksoa), niin HIV-1 viruksen vapautuminen tulee herkäksi adamantaaneille amantadiinille ja rimantadiinille, jotka ovat anti-influenssalääkkeitä ja blokeeraavat M2 jonikanavan aktiivisuuden (2006)

Virusten vapautumisen liittyvisä seikoissa on edelleen hämäriä kohtia ( Miten jonikanavien aktiivisuus indusoi virionin vapautumisen kiihtymistä?) Vpu ei johda protoneita ja HIV-1 Env ei ilmennä pH:sta riippuvaista fusogeenisyyttä ( siis näissä kohdin HIV virus eroaa AIV influenssaviruksessa havaittavista ilmiöistä).

(VRT: A- Influenssaviruksessa M2 proteiini välittää neutralisoitumista pH gradientissa sekretorisen tien varrella, missä normaalisti lisääntyy happamuus eli pH arvo laskee endoplasmisesta retikulumista plasmamembraania kohti. Tämä influnssaviruksen vaikutuksesta tapahtuva neutralisoiminen periferiassa sallii reseptoriin sitoutuneen hemagglutiniiniproteiinin (HA) välttää rakenteellisia muutoksia, mistä seuraisi ennen aikainen fuusioitumiskyvyn menettäminen).

Molemmat virukset aiheuttavat viiveen biosynteettisten kalvosysteemien eritysteihin. Tämä osaltaan vaikuttaa HIV-1 viruksen Vpu proteiinin kykyyn vähentää MCH 1 luokan tunnistus moduleita solupinnalta Sellainen viitytys vaikuttaa viruksen vaipan ( envelope) glykoproteiinien posttranslationaaliseen modifikaatioon, mutta toisaalta Vpu ei vaikuta Env:n proteolyytiseen pilkkoutumisen eikä sen glykosylaatioon.

• Virionin vapautumisen kiihdytyksestä

Kahdenkymmennen vuoden Vpu- proteiinin tutkimusten jälkeen löydettiin luonnollisen immuunipuolustuksen uusi komponentti BST-2, " interferonien indusoima solutekijä, joka rajoittaa virusten vapautumista infektoituneista soluista".(Neil et al. 2008, Van damme et al. 2008).

Jos Vpu puuttuu, virionit akkumuloituvat solupintaan ja endosomaalisiin rakkuloihin, joista monet ovat klatriinin (clathrin) peittämiå ja peräisin plasmakalvosta. Viruksen luonnollisissa isäntäsoluissa CD4+ T-imusoluissa ja makrofageissa vpu:ta on. Samaa tyyppiä vpu:ta ei aina ilmene muissa soluissa. Samat solutyypit, jotka käyttävät Vpu-välitteistä HIV-1 virionien vapautumista käyttävät samanlaista vaikutusta muissa retroviruksissa ja jopa virusten kaltaisia partikkeleita (VLP) vstaan ja Ebolaviruksessa. Näistä päätellen Vpu toimii soluproteiinitasossa eikä niinkään virusproteiinitasossa virionin lisämääriä puoltaessaan.

Heterokaryon: Jos ne solut, jotka käyttävät Vpu proteiinia, fusoituvat sellaisiin soluihin, jotka eivät käytä Vpu:ta, syntyneessä heterokaryonissa aletaan käyttää Vpu:ta Tästä päätellen virusten vapautumisessa läsnäoleva soluinhibiittori on jokin sellainen, mihin Vpu vastavaikuttaa.
Eräs proteaasi (subtilisiini) kykenee vapauttamaan ehjän solun pidättämiä virioneja, mikä viittaisi tämän inhibiittorin olevan solun pintaproteiini.
Lisäksi solut, joissa ei ilmene inhibiittoria, voivat indusoitua expressoimaan tätä oletettua inhibiittoria I-tyypin interferonilla. Tämä identifioitiinkin 2008: Sillä on muitakin nimiä kuin BST-2, kuten HM1.24 ja CD317. Tämä proteiini on sittemmin kutsuttu myös tetheriini nimellä, koska se pystyy pidättämään vastamuodostuneita virioneja infektoituneen solun pinnalla (virion-tethering)
Siis Vpu vastavaikuttaa solun tetheriiniin ja kiihdyttää virusten vapautumista solusta. Yksinkertaisin selitys olisi, että Vpu vähentää tetheriinin määrää plasmakalvossa, mikä on tämän BST-2:n toimintakohta tetheriinitekijänä ( tetherin factor).

• Yksinkertaistettu kysymys: Mikä on Vpu:n osuus evaasiossa, ihmisen immuunipuolustuksen kiertämisessä?

Juuri yllä on mainittu vuonna 2008 keksitty luonnollisen antiviraalisen mekanismin tetheriinin (BST-2) vaikutuksen vastavaikutus.

Yllä on mainittu myös että Vpu vaikuttaa modulaatiota luonnollisen immunivasteen tärkeisiin kontrollanttireseptoreihin, MHC I ja II luokan molekyyleihin (MHC= Major Histocompatibility; kudossopivuuden kontrollantteja, jotka analysoivat viruksen ym vieraan proteiinin).
Vpu säätää MCH-I molekyylin biosynteesin ja solun pinnalla ilmenemisen vaimeaksi. Vpu lisää MCH-I:n hajoamista proteomisilppurissa. Tästä pääsee virusantigeeni lisääntymään ja täten virus myös järjestää sytotoksisten T- CD8 solujen vältön, sillä ne olisivat viruksen replikaation kontrollantteja ja infektoituneen solun täystuhoajia.

Vpu säätää alas myös MCH II molekyylin, jolloin mahdollisesti Vpu olisi osaltaan avustanut immunologista evasioita vähentämällä antigeenin presentaatiota CD4 +T-soluille adaptatiivisen immuunivasteen aikana.

CD40 näyttää säätyvän ylös endoteelisoluissa, dendriittisoluissa ja makrofageissa . Se on TNF- reseptorisuperperhettä.


Soluproteiinien interaktio: Näistä tiedetään parhaiten interaktio Vpu:n ja beeta-TrCP:n kesken ( beeta- transducin repeat-containing protein) Se on substraatti multi-alayksikölliselle E3 ligaasikompleksille SCF. Interaktiosta seuraa CD4- ja mahdollisesti BST-2_ ubikitinylaatiot ( ja silppuroitumiset, hajoamiset).

CD4 hajoaa jos Vpu tekee siihen interaktio . Interaktio tapahtuu molempien proteiinien soluliman puolella olevien päätyjen, membraanin tyvessä olevien kohtien kesken Interaktion rakenteellinen tausta ei niin ole tiedossa, mutta kartoituksissa on havaittu CD4:ssa lähellä kalvoa oleva jakso KRLLSEKKT joka on osin alfahelixmuotoa. Vpu omaa taas jakson YRK ja DRLI kalvontyvessä olevassa alfahelixosassaan. Arvellaan näitten proteiinien välisen interaktion tapahtuvan mainittujen jaksojen kesken.
http://www.biomedcentral.com/content/figures/1741-7015-7-48-2-l.jpg http://www.biomedcentral.com/content/figures/1741-7015-7-48-2-l.jpg

BST-2 rakenne on tyypin II transmembraanisten proteiinien ( N-pääty on sytoplasminen ja C-pääty luminaalinen). Kirjan kuvassa se on kaunis kuin helminauha tai kaulakoru. Se on alfa-helix. Kalvotopologiassa on epätavallisuutta ja lisäksi siinä on transmembraaninen jakso. C-terminaalissa on GPI-ankkuri ( glykosyylifosfatidyyli-inositoliankkuri), siis molekyyli tekee kaksi kertaa interaktion fosfolipidikaksoiskerrokseen. Tämä taitavan bifunktionaalinen sitoutumiskyky antaa sille mahdollisuuden pyydystää vastasyntyneitä virioneja soluun tekemällä siltoja solun ja virionin kalvojen kesken. BST-2 liittyy GPI -ankkurinsa kautta kalvodomaanin kolesterolipitoisiin levymäisiin kohtiin. Tällainen asettuminen on puolustavalle proteiinille ideaalinen, koska tiedetään HIV-1 virioneitten, influenssavirusten sekä Ebolaviruksen virioneitten purkautuvan esiin juuri näistä ( lipid raft) kohdista.
http://www.pangeome.org/storage/tetherin.jpeg?__SQUARESPACE_CACHEVERSION=1268528798070 http://www.pangeome.org/storage/tetherin.jpeg?__SQUARESPACE_CACHEVERSION=1268528798070 /a

Itseasiassa ei vielä vuonna 2009 tunnettu BST-2 molekyylin rakennetta, mutta sen malli on kyllä hyvin kauniina esitetty. Se on miltei kokonaan alfa-helikaalinen. Sen transmembraaninen osa, samoin sytoplasminen osa ovat alfa-helix- rakenteisia. Oletetaan, että alfa-helikaalinen ektodomaani (luminaalinen domaani) muodostaisi coiled coil-hiuspinnin, mikä toisi C-terminaalisen osan ja GPI-ankkurin jälleen luminaaliselle puolelle. Sytosolisella puolella on kaksi lysiiniä todennäköisesti ubikitinaatiokohdat. Natiivi BST-2 lie cysteiinillä linkkiytynyt dimeeri.
Tarkasti ei tiedetä, miten BST-2 saa ne virukset pyydystettyä paitsi että tarvitaan sekä C-terminaaliset että sytoplasmiset domaanit. Siis se voisi pidättää virionin soluun transmemebraanisella domaanillaan plasmakalvossa ja upottamalla GPI-ankkurinsa virionin kuoren kolesterolipitoisiin kohtiin. Tai BST-2 voisi inkorporoitua virioneihin ja dimerisoitua virionin ja soluun liittyneen BST-2:n kanssa tehden täten sidoksen.

Aivan tarkasti ei myöskään tiedetä, miten Vpu selviää BST-2.sta, mutta arvellaan, että se poistaa niitä plasmakalvosta. Kaksi Vpu domaania työskentelee funktionaalisesti yhdessä tässä aktiviteetissa. BST-2:n vaimennussäätö vaatii Vpu:n transmembraanista domaania ja seriinipitoista sekvenssiä sytosolin puolelta.

BST-2 esiintyy konstitutiivisesti aktivoiduissa T-soluissa, mutta myös B-solujen pinnoilla ja plasmosytoidisissa dendriittisoluissa. Jälkimmäiset ovat professionaalisia APC-soluja ( antigen presenting cells).
BST-2:n asema voi olla luonnollisen immuniteetin ja adaptiivisen immuniteetin välimaastossa, mistä taas seuraisi sekundäärinen syy viruksen taholta kehkeytettyyn antagonismiin täysin riippumatta infektoituneista soluista vapautuvien virionien restriktiosta.

• CAML

Kalsiumin moduloiman syklofiliiniligandin (CAML) on viime aikoina havaittu olevan Vpu:n sitoutumispartneri ainakin hiivassa.
CAML sijaitsee endoplasmisessa retikulumissa eikä plasmakalvossa solupinnalla.
CAML sitoo cyklofiliini B:tä.
CAML tarvitaan BST-2:n takaisin kierrätykseen plasmakalvoon.

Muita seikkoja mainittakoon

• UBP

U-sitova proteiini) soluproteiini, joka asettuu interaktioon Vpu:n kanssa, Glutamiinipitoinen tetratricopeptiditoistoproteiini (SGT), avainjakso KILRQ. Chaparone perhettä, tekee interaktiota Gag proteiiniin. UBP yliexpressio omaa negatiivista vaikutusta virusten vapautumiseen. Vpu katkaisee UBP ja Gag liitoksen.
Onko Vpu myös UBP antagonisti? Keskustelun aihe.

• TASK-1

solun kaliumkanava neljine transmembraanisine domaaneineen
TASK-1, Sen N-terminaalilla on homologinen jakso Vpu:n transmembraanisen osan kanssa. Vpu estää TASK-1 johtuvuutta. TASK-1 estää Vpu:n aiheuttamaa virionien vapautumisen kiihdyttämistä. TASK-1:n N-terminaalillakin voi olla kohtalaista Vpu:n kaltaista virionien vapautumista lisäävää vaikutusta.