APOBEC, A3G solun antivirustekijä ja HIV-1 Vif

Vif koettaa tunnistaa solun APOBEC puolustuksen ja tuhota sen. Siis  Vif  isäntäsolussa  esittää kohteliaasti  solun  tärkeälle  virusmateriaalin  poistosysteemille kohteliaasti  viitan roskakoriin. Kuitenkin osa  APOBEC materiaalista saa tunkeuduttua uuteen  viruskapsidiin, mutta silloin  on jo virus  jo niskanpäällä  käyttää sitä hyödyksi  geneettiseen  muuntuvaisuuteensa- joka on  on tässä  evaasion lantin  toinen puoli,   mutta  vielä uudessakin infektoituneessa solussa  APOBEC saattaa  häiritä virusreplikaatiota niin että osa  materiaalista  kuitenkin  ohjelmoituu  tuhoutumaan, vain osa menee  tumaan muuttumaan uuden viruksen uudeksi  rekreatoituneeksi geneettiseksi materiaaliksi. Taistelu Vif ja APOBEC-  välillä on  hyvin rajua. 

http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/files/publicaffairs/mono18fig2.gif

Miksi viruksen on tarvinnut kehittää aivan spesifisesti APOBEC-järjestelmän vastainen tuhoproteiini?


APOBEC ( sytidiini deaminaasi) on antivirusvaikutteinen mekanismiltaan. Sen A3G ja A3F mutanteillakin on vielä anti HIV-1 vaikutusta viruksen käänteiskopioinnin ( reverse transcription) estämisessä . Tiedot ovat vuosilta 2006- 2007.

• Yksi mekanismi on seuraava:

Varhaisen virusperäisen DNA- muodon estämisessä A3G inhiboi varhaisen minus sense strong stop DNA:n ja tRNA3Lys ei pystynyt valmentamaan (prime) käänteiskopiointia. A3G vähensi tRNA3Lys kykyä sitoutua virusRNA:han ja panna alkuun käänteistä kopiointia. Myös A3F osoitti samoja tuloksia.

• Toinen mekanismi on kuvattu 2007.

A3G indusoi sekä miinus että plus DNA säikeen siirron/ vaihdon (transfer) estymisen käänteiskopioinnissa ja täten on päätekijä myöhäisen DNA-synteesin reduktiossa ja
DNA plus säikeen integraatiossa.
Sitäpaitsi sellainenkin A3G, jonka deaminaasi oli defektiivinen, saattoi johtaa sekä defektiiviseen plus-DNA-säikeeseen että defektiiviseen DNA integraatioon ( provirukseksi)

• Kolmas mekanismi

A3G voi estää käänteisen transkriptaasientsyymin (RT)  katalysoiman DNA:n pidentymän mutta ei omannut mitään vaikutusta RNaasi H aktiivisuuteen tai nukleokaopsidiproteiinin NC kykyyn toimia nukleiinihappochaperonina.

• Vaikuttamisvaiheen ajoitus

Ajallisesti A3G vaikuttaa estämällä uusia infektioita kun se on itse pakkautuneena  ( encapsidated) vasta purkautuneisiin uusiin vironeihin ( newly budded viruses)
Mutta se saattaa myös vaikuttaa viruksen sisääntulon jälkeen (post - entry ) ja blokeerata HIV-1 virusta lepäävissä T-soluissa (2005 havainto) ja dendriittisoluissa ( 2006). Mutta aktivoidut CD4+T imusolut ovat hyvin sallivia wt HIV-1 infektiolle. Sensijaan lepäävät PBMC solut vaikuttavat pystyvän vastustamaan infektiota ( 2005).

• Yksityiskohtia APOBEC eri kertymismuodoista HMM,  LMM

Aktivoiduissa CD4+T soluissa APOBEC A3G esiintyy suurimolekulaarisena ribonukleiinikompleksina HMM, mutta lepäävissä CD4+ T soluissa sitä on entsymaattisesti aktiivina matalamolekulaarisena LMM muotona. LMM muotoinen A3G aiheuttanee post-entry blokin varhain HIV-1 viruksen replikaatiosyklissä huonontamalla käänteiskopiointia. Vaihde LMM muodosta HMM muotoon tapahtuu mitogeeni ja sytokiiniaktivaatioista ja samalla yksilö muuttuu alttiimmaksi HIV-1 virukselle. (2007). SiRNA, joka kohdistuu A3G-tekijään stimuloitumattomissa CD4+T soluissa, muuttaa solut HIV-1 virusta salliviksi.

• Havainto APOBEC proteiinien tuntemattomasta vaikutuksesta

Kun on sekvensoitu käänteiskopioivaa entsyymiä (RT), siinä on havaittu matala pitoisuus G-A hypermutaatioita mikä viittaisi varhaisen restriktion olevan deaminaaseista riippumatonta. Kuitenkin tämä restriktio ei ole absoluuttista koska vastasyntynyttä uutta virus DNA:ta havaitaan lepäävissä CD4+ T-soluissa 24- 48 tunnin viiveellä.( 2005). Joissain tapauksissa on havaittu myös inaktiivisten T-solujen sallivan HIV-1 viruksen infektion ( 1992).

Tämän lisäksi on havaittu, että useat APOBEC proteiinit näyttävät estävän HBV, AAV, IAP, MusD ja LINE-1 deaminaasista riippumattomalla tavalla, mikä ei ole vielä pystytty osoitamaan (2006). On luotu ajatus alternatiivisesta ja deaminaasista riippumattomasta inhibitorisesta mekanismista (2006).
Jotkut pitävät seikkaa proteiinin yliexpressiosta johtuvana, mikä olisi paljon yli fysiologisten pitoisuuksien.
Jos A3G:n aktiivikohta mutatoidaan, sen antivirusvaikutus häviää niissä pitoisuuksissa, mitä primäärisissä T-soluissa esiintyy.
Toinen tutkija osoitti että A3G:n katalyyttinen kohta ja DNA sytosiinideaminaatio ovat tärkeitä tämän APOBEC-tekijän inhiboivassa vaikutuksessa Ty1, MusD ja HIV-1 viruksen suhteen, kun A3G tekijää oli lähes fysiologiset määrät.

Asia ei kutienkaan sulje pois sitä mahdollisuutta, että on olemassa deaminaasista riippumatonkin vaikutus, koska aktiivit mutantit myös blokeeraavat tärkeän proteiinifunktion kuten proteiini-proteiiniinteraktion tai proteiini-DNA/RNA-interaktion.

• Minkä näköinen on APOBEC-proteiini?

Tästä on kuvia Internetissä  Suurin osa kuvista kuitenkin esittää sen suhteessa HIV-1 virukseen, minkä takia se on oikeastaan havaittu ja tutkittu.
Vuodelta 2008 on siitä rakenteellisia kuvauksia Sen kiteessä on viisi Beeta-tuppea ja niitä ympäröi ehkä kuusi alfa-helixiä. A3G omaa yhden pitkän ja selkeän beeta2säikeen Kaksi aktiivin keskuksen silmukkaa on lähellä aktiivia kohtaa, jossa cytosiini deaminoituu. On havaittu kolmaskin rakenne , johon ssDNA voi sitoutua. Se on alfahelixin alueella.

• Miten APOBEC pystyy pakkautumaan uusiin virioneihin?

Jotta APOBEC ylipäätänä pystyisi  estämään HIV-1 virusta, sen on tehokkaasti pakkauduttava isäntäsolusta erkanemaisillaan oleviin uusiin virioneihin ( newly budded virion). Tutkimukset ovat osoittaneet, että A3G sitoutuu HIV-1 viruksen Gag-proteiiniin ja varsinkin nukleokapsidin (NC) alueeseen HIV-1 Gag on välttämätön ja riittävät A3G APOBEC-proteiinin pakkautumiselle uuteen virioniin. Tämä tutkimus tosin on tehty vain viruksen kaltaisilla partikkeleilla (VLP) eikä koko viruksella, joten saattaa olla muitakin vaatimuksia (2004).

Useimmat tutkijat ovat sitä mieltä, että RNA-interaktio lisää kovasti A3G APOBECproteiinin pakkautumista virioniin. Vaikka A3G näyttää editoivan vain ssDNA muotoa se on siitä huolimatta kykenevä sitoutumaan vahvasti RNA-rakenteeseen. (2007). Gag proteiinin NC-regio on myös tärkeä tässä RNA-interaktiossa ja yhdessä A3G:n kanssa muodostuu proteiini:RNA kompleksi (2007).

APOBEC proteiinin A3G N-terminaalinen sytidiinideaminaasi vastaa proteiiniin sitoutumisominaisuuksista ja vaikuttaa pakkautumiseen, kun taas C-terminaalinen domaani vasta deaminaatioista (2006). N-terminaalisessa alueessa on tunnistettu spesifisiä kohtia, jotka vaikuttavat pakkaantumiseen, erityissti tryptofaani W127, joka näytti olevan tärkeä RNA-rakenteeseen sitoutumisessa.

Vaikka monet ovat sitä mieltä, että RNA-interaktio on tärkeä tehokkaassa antivirussproteiinin APOBEC:in pakkaantumisessa virioneihin mukaan, niin tuon RNA:n luonne on edelleen väittelyn aiheena

Yksi kandidaatti RNA on HIV-1 viruksen genominen RNA. Tutkimukset osoittivat, että vaikka A3G voisikin onnistuneesti pakkautua ilman virusRNA:ta, tällaiset A3G molekyylit eivät olisi virioneissa virusytimeen ( viral core) liittyneinä. A3G molekyylit kykenisivät uudelleen liittymään virusytimeen ( viral core), jos lisätään viruksen RNA:ta tutkittavaan materiaaliin.

Toinen RNA-kandidaatti on soluperäinen RNA ja signaalintunnistuspartikkelin SRP komponenti, 7SL RNA. Onkin voitu osoittaa että tätä lajia proteiinia pakkautuu runsaasti ja selektiivisesti HIV-1 virioneihin (2007)
Sekä A3G mutantit että viruksen NC mutantit, joilla on pakkautumispuutteita ovat osoittaneet vähentynyttä kykyä sitoa ja pakata 7SL RNA: ta. ( 2007). Se ei kuitenkaan ole essentielli tekijä A3G pakkautumiselle (2008).

• Antivirusvaikutukselle on mekanimsin lisäksi myös olennaista pakkaustapahtuman paikallistuminen, lokalisaatio.

A3A, eräs toinen APOBEC3 perheen jäsen, on vahva estäjä useillekin retroelementeille, mutta se ei vaikuta HIV-1 virukseen. Mutta jos A3A kohdistetaan viruksen ytimeen ( viral core) muodostamalla fuusioproteiini Vpr- A3A, niin silloin tämä sytidiinideaminaasi pystyi rajoittamaan HIV-1 ja SIV viruksia Vif-tekijästä riippumattomalla tavalla (2008). Täten näyttää olevan ilmeistä että eri APOBEC-proteiinit ovat erilaistuneet käyttämään erilaisia retroviruksiin kohdistuvia mekanismeja, ilmeisesti laajentamalla täten APOBEC- proteiiniperheen viruskohteitten kirjoa.

• Vif tuhoaa monipuolisesti APOBEC proteiiniperheen antivirusvaikutusta

SIV ja HIV-1 ja monet retrovirukset ovat kehittäneet tuntuvan aseen solun antivirusarsenaalia kohtaan.
Lentivirukset HIV-1 ja SIV koodaavat Vif proteiinia, joka pystyy merkkamaan APOBEC-proteiinit ubikitinaatioon ja silppuroitumaan solun omassa proteiinisilppurissa. (2003- 2005).
http://groups.molbiosci.northwestern.edu/matouschek/images/sequential.gif

Vif proteiini tekee kompleksin Cul5, adaptorien Elongiini B, Elongiini C ja Rbx1 proteiinien kanssa ja muodostaa E3-ubikitiiniligaasin.


(E3 ubikitiiniligaasit ovat kriittisiä soluprosessien normaalisäätelijöitä mitoosissa ja solusyklissä kun pitää kohdistaa proteiinejä häviämään ( hajoittumaan) ( 2004)).

Lisäksi Vif edistää APOBEC vaihdetta LMM muodosta HMM muotoon, mikä sallii viruksen paremmin.

Ei vielä tiedetä miten eri HIV-1 Vif tekijät voivat tunnistaa erilaiset ABOBEC- molekyylit. Ainakin ihmisen kolmessa A3G molekyylissä oleva aspartaatti (128)D näyttää olevan Vif tekijälle yhtenä tunnistusmerkkinä.
Fosforylaatiot ovat myös säätelevä tekijä Vif , A3G ja proteosomisilppurin välisissä proteiini-interaktioissa.

• Vif vaikuttaa solussa muullakin tavalla kuin tuhoamalla APOBEC proteiinien antivirusvaikutuksia.

Muun muassa Vif aiheuttaa solusyklin viivästymisen. Ajatellaan että HIV-1 viruksen Vpr normaalisti vastaa solusyklin pysähtymisestä G2 vaiheeseen CD4+ T soluissa. Mutta vaikka Vpr puuttui , kertyi soluja jotka olivat pysähtyneet G2 vaiheeseen. Havaittiin tapahtuman olevan riippuvainen Vif-tekijästä. Vif yksinään HIV-1 infektiossa kohottaa G2:G1 suhdetta soluissa (2007). Mutta Vif ei estänyt solun jakaantumista eikä laskenut jakautuvien solujen määrää. G2 disruptiossa hajoavaa substraattia ei ole tunnistettu.

• Vif sitoutuu muihinkin soluproteiineihin kuin APOBEC-perheen jäseniin:

Ku70 proteiiniin joka osallistuu DNA:n kaksoissäikeen katkeaman (DSB) korjaamiseen.

HIV-1 preintegraatiokomponenttiin:
Ku70/ 80 voi toimia ssDNA:sta riippuvana helikaasina.
Jos Vif rekrytoi varhain Ku70 HIV-replikaatiosyklin aikana, se voi avustaa HIV-1 PIC integraatioprosessia.

Src-perheen tyrosiinikinaasin Hck. Tämä on proteiini, joka pystyy estämään HIV-1 virusten tuotantoa ja infektiivisyyttä, kun Vif puuttuu viruksesta. Sevoi muutaa solut myös vhemmän virusta salliviksi. Hck esiintyy monosyyteissä. Hck sitoutuu myös HIV-1 viruksen Nef-proteiiniin ja eräässä muodossaan voi estää HIV-1 viruksen Nef-tekijän indusoiman MHC I luokan modulin vaimennussäätymisen.

SP140 ( nuclear speckle factor) tumatekijään, jota esiintyy non-permissiivisissä soluissa, mutta ei permissiivisiisä soluissa. Vif aiheutti SP140 hajantuman tumatäplistä tai pidättymän sytoplasmaan. Tämä aines nimitetään PML kappaleiksi ja niillä on jotain funktiota transkriptiossa, DNA:n korjauksessa, viruspuolustuksessa, solustressissä, solun syklin säädössä, proteiinien hajoamisessa ja apoptoosissa (2007)

SSAT, polyaminimetaboliaan osallistuvaan proteiiniin, mikä vaikutaisi viruksen RNA:han.

A- syklofiliiniin ( cyclophilin A), peptidyyli-prolyyli cis-trans isomeraasi (PPIaasi) perheeseen, joka tekee interaktion monen HIV-1 proteiinin kanssa, myös p55 Gag proteiinin kanssa. A-dyklofiliini näytää olevan välttämätön infektioivien HIV virionien muodostamisessa ja NVBP proteiinissa, joka on uusi Vif-tekijää sitova proteiini.

UUSINTA TIETOA Vif ja APOBEC aiheesta netistä haettu tänään 15.12. 2011.

J Neuroimmune Pharmacol.
 2011 Jun;6(2):296-307. Epub 2011 Jan 29. HIV-1
 Vif interaction with APOBEC3 deaminases and its characterization by a new sensitive assay.

Cadima-Couto I, Saraiva N, Santos AC, Goncalves J.

Source

URIA-IMM, Faculdade de Farmácia da Universidade Lisboa, Av. Das Forças Armadas, 1649-059 Lisbon, Portugal.

Abstract

The human APOBEC3 (A3) cytidine deaminases, such as APOBEC3G (A3G) and APOBEC3F (A3F), are potent inhibitors of Vif-deficient human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).
HIV-1 Vif (viral infectivity factor) binds A3 proteins and targets these proteins for ubiquitination and proteasomal degradation. As such, the therapeutic blockage of Vif-A3 interaction is predicted to stimulate natural antiviral activity by rescuing APOBEC expression and virion packaging.
In this study, we describe a successful application of the Protein Fragment Complementation Assay (PCA) based on the enzyme TEM-1 β-lactamase to study Vif-A3 interactions.
PCA is based on the interaction between two protein binding partners (e.g., Vif and A3G), which are fused to the two halves of a dissected marker protein (β-lactamase). Binding of the two partners reassembles β-lactamase and hence reconstitutes its activity.
To validate our assay, we studied the effect of well-described Vif (DRMR, YRHHY) and A3G (D128K) mutations on the interaction between the two proteins.
Additionally, we studied the interaction of human Vif with other members of the A3 family: A3F and APOBEC3C (A3C).
Our results demonstrate the applicability of PCA as a simple and reliable technique for the assessment of Vif-A3 interactions. Furthermore, when compared with co-immunoprecipitation assays, PCA appeared to be a more sensitive technique for the quantitative assessment of Vif-A3 interactions.
Thus, with our results, we conclude that PCA could be used to quantitatively study specific domains that may be involved in the interaction between Vif and APOBEC proteins.

Kommenttini:
Tieteen taso tästä aspektista on edelleen tutkimusten täsmentämisissä ja proteiinien keskeisten vuorovaikutuksten selventämisesä, eikä mitään varsinaista uutta terapeuttista ikkunaa toistaisekei ole muodostunut.
Joten käytän vanhaa rutiinisanontaani. KAIKKI ihmisen antivirupuolustusjärjestelmät koostuvat proteiineista, joten en hyvän peruskunnon luominen on tärkää ja siihen kuuluu tasapainotettu järkevä ruoka, jossa proteiinien pitoisuus on todellakin olemassa ( Suositusten mukaan energiasta pitäisi olla proteiinia (10) 15- 20 E% olettaen että päivän energiatasot ovat energiansaannin viitearvojen rajoissa.
Mitä tulee pandemisiin viruksiin niitten preventiosta on WHO:n ohjeet.