Kuva HSV-1 genomista

https://www.researchgate.net/profile/Filip_Lim/publication/259626032/figure/fig1/AS:337840660598784@1457558898550/Fig-1-Genome-organization-of-Herpes-Simplex-Virus-Type-1-HSV-1-and-gene-expression.png
 +Netistä löytyy
myös hyviä videoita herpse Simplex-1 viruksen infektiosyklistä.
https://www.youtube.com/watch?v=foo0ioyG0ig
Tämäkin valiasee hyvin asiaa. Varsinkin miten tegumenmateriaali poimitaan virioniin mukaan.

Uusi teesi 2018 HSV-1 viruksesta Götgeborgin yliopistosta

Väittelija on  Zhiyuan Zhao.
Väitöstyön nimi:  Molecular aspects on herpes simplex virus  type 1 DNA replication and gene expression.  Väitöstilaisuus on vielä edessä päin 26.1. Carl Kylberg salissa ja opponentti on Uumajan  yliopistosta   professori E Johansson.
Väitöstyön  abstraktin ja osatöiden sisältöä  saa tietää  lähteestä
http://hdl.handle.net/2077/53912 
Tässä työssä tutkijat ovat  selvitelleet HSV-1 virusproteiinien keskinäistä vuorovaikutusta  viruksen  molekulaarisessa koneistossa.
 Lisäksi he ovat tutkineet niitä molekulaarisia tarpeita, mitä viruksen DNA-replikaatiosta riippuvaisten myöhäisten geenien ilmenemiseen vaaditaan.  Tarkka tieto  näistä molekyylitason  tapahtumista on avuksi kehiteltäessä antivirusterapioita ja ehkä  edistyy samalla  tietämys  omien solujemmekin vastaavista tapahtumista.

Tutkijaryhmä on osoittanut lajispesifiseksi  ne   HSV-1 viruksesta löydetyt  seitsemän proteiinia, jotka  ovat   sen DNA-replikaatiossa  välttämättömiä.  Niitä proteiineja ei voi korvata  lähisukuisen viruksen homologisella proteiinilla. Siis ne seitsemän replikaatioproteiinia muodostavat eräänlaisen molekulaarisen koneiston, replisomin ja sille on ominaista lukuisat proteiini_proteiini-interaktiot.

Lisäksi tutkijaryhmä tunnisti HSV-1-helikaasi-primaasi-kompleksista entsymaattisesti inaktiivin  UL8-proteiinin tärkeät aminohapot. Tämä  UL8 tarvitaan interaktioon  primaasikompleksin  UL52- komponentin kanssa.  Jos näissä UL8- aminohapoissa oli mutaatio,  interaktio  vaikeutui ja replisomin  DNA-replikaatiokapasiteetti  väheni tai jäi pois ei-permissiivisessä lämpötilassa.

Sitten tutkijat selvittivät  HSV-1- viruksen helikaasi-primaasikompleksin UL52- komponentin  ja muiden replikaatioproteiinien  väliset interaktiot. He havaitsivat UL52-proteiinista erilaisia domaaneja ja joka domaanilla oli eri interaktiopartneri.  UL52-N-terminaali teki  stabiilin interaktion UL5:n kanssa. Keskimmäinen domaani teki stabiilin interaktion UL8:n kanssa.  UL52-C-terminaali teki vain  ohimenevän heikon interaktion UL5:n kanssa.

Uudet  anti-HSV-1-lääkkeet   kohdentavat vaikutuksensa juuri helikaasi-primaasikompleksiin, mutta ei ole tiedetty, millä tavalla ne ovat inhibitorisia eli replikaatiota estäviä. Nyt tutkijaryhmä on osoittanut, että  nämä uudet lääkkeet estävät  HSV-1 DNA:n replikaation  vaikuttamalla UL5- ja UL52-  proteiinien väliseen interaktioon.  He ovat sitä mieltä, että lääkkeet lukitsevat nämä proteiinit tiettyyn konformaatioon estäen niitä olemasta avuksi viruksen DNA:n replikoitumisessa.

Tämän helikaasi-primaasi-kompleksi-interaktion lisäksi  UL52-proteiinin keskimmäinen domaani ilmentää  stabiilia vuorovaikutusta  UL29/ICP8- nimiseen proteiiniin, joka on  HSV-1 -viruksen ssDNA:ta sitova proteiini.
Näiden kahden proteiinin välinen  interaktio voisi antaa viitettä, miten  helikaasi-primaasikompleksi on HSV-1 genomissa  pakattuna  aktivoituun  replikaation alkukohtaan ja syntetisoi primeereitä   ICP8:lla verhotuilla ssDNA säikeillä.

Viraali  DNA-replikaatio on edellytys HSV-1 viruksen  todellisten myöhäisgeenien ilmenemiselle.   Tutkijaryhmä osoitti myös, että näiden todellsiten  myöhäisten geenien ilmenemä riippuu spesifisesti CDK9-kinaasista, joka on isäntäsolun proteiinikinaasi ja osallistuu solun transkription säätelyyn.  Jos  CDK9 estettiin, vaikuttui viruksen  myöhän mRNA:n transkriptio ja sen  kertymä  sytosoliin.   Toinenkin soluproteiini oli tarpeellinen viruksen myöhäisten geenien ilmenemiselle. Se on   transkriptiotekijä SPT5, joka on CDK9-kinaasin susbtraatti. CDK9-aktiivisuutta virus tarvitsi välttämättä  SPT5:n ja virusproteiini C27:n  väliseen interaktioon;  arvellaan sellaista vuorovaikutusta  tarvittavan  viraalin myöhäisen mRNA:n kypsymiseen ja kuljettamiseen pois  tumasta

 Tulokset viittaavat siihen, että HSV-1 -viruksen varsinaiset myöhäiset geenit ainakin osittain säätyvät  viraalin myöhäisen  mRNA:n  kypsymisestä ja tumasta poiskuljetuksesta 

I. Muylaert, I, Zhao, Z, Andersson, T, Elias P. Identification of Conserved Amino Acids in the Herpes Simplex Virus Type 1 UL8 Protein Required for DNA Synthesis and UL52 Primase Interaction in the Virus Replisome J Biol Chem. 2009 July; 287(40): 33142-52. VIEW ARTICLE II. Muylaert I, Zhao, Z, Elias P. UL52 Primase Interactions in the Herpes Simplex Virus 1 Helicase-Primase Are Affected by Antiviral Compounds and Mutations Causing Drug Resistance J Biol Chem. 2014 October; 289(47): 32583-92. VIEW ARTICLE III. Zhao, Z , Tang KW , Muylaert I, Samuelsson T, Elias P. CDK9 and SPT5 proteins are specifically required for expression of herpes simplex virus 1 replication-dependent late genes J Biol Chem. 2017 July; 292(37): 15489-00. VIEW ARTICLE

Date of Defence:

2018-01-26

HSV-1 Herpes simplex virus on aktiivin tutkimuksen kohde

PubMed  haku

Structure of the Herpes Simplex Virus 1 Genome: Manipulation of Nicks and Gaps Can Abrogate Infectivity and Alter the Cellular DNA Damage Response

Samantha Smith, Nina Reuven, Kareem N. Mohni, April J. Schumacher, Sandra K. Weller

J Virol. 2014 Sep; 88(17): 10146–10156. doi: 10.1128/JVI.01723-14

PMCID:

PMC4136335

Article PubReader PDF–1.0MCitation

Is Cited by the Following 12 Articles in this Archive:

The Non-Homologous End Joining Protein PAXX Acts to Restrict HSV-1 Infection

Ben J. Trigg, Katharina B. Lauer, Paula Fernandes dos Santos, Heather Coleman, Gabriel Balmus, Daniel S. Mansur, Brian J. Ferguson

Viruses. 2017 Nov; 9(11): 342. Published online 2017 Nov 16. doi: 10.3390/v9110342

PMCID:

PMC5707549

Article PubReader PDF–3.1MCitation

The Exonuclease Activity of Herpes Simplex Virus 1 UL12 Is Required for Production of Viral DNA That Can Be Packaged To Produce Infectious Virus

Lorry M. Grady, Renata Szczepaniak, Ryan P. Murelli, Takeshi Masaoka, Stuart F. J. Le Grice, Dennis L. Wright, Sandra K. Weller

J Virol. 2017 Dec 1; 91(23): e01380-17. Prepublished online 2017 Sep 27. Published online 2017 Nov 14. doi: 10.1128/JVI.01380-17

PMCID:

PMC5686714

Currently embargoed: Free in PMC on May 14, 2018; PubMed

The Herpesvirus Nuclear Egress Complex Component, UL31, Can Be Recruited to Sites of DNA Damage Through Poly-ADP Ribose Binding

Maxwell R. Sherry, Thomas J. M. Hay, Michael A. Gulak, Arash Nassiri, Renée L. Finnen, Bruce W. Banfield

Sci Rep. 2017; 7: 1882. Published online 2017 May 15. doi: 10.1038/s41598-017-02109-0

PMCID:

PMC5432524

Article PubReader PDF–3.6MCitation

An Intrinsically Disordered Region of the DNA repair protein Nbs1 Is a Species-Specific Barrier to Herpes Simplex Virus 1 in Primates

Dianne I. Lou, Eui Tae Kim, Nicholas R. Meyerson, Neha J. Pancholi, Kareem N. Mohni, David Enard, Dmitri A. Petrov, Sandra K. Weller, Matthew D. Weitzman, Sara L. Sawyer

Cell Host Microbe. Author manuscript; available in PMC 2017 Aug 10.

Published in final edited form as: Cell Host Microbe. 2016 Aug 10; 20(2): 178–188. doi: 10.1016/j.chom.2016.07.003

PMCID:

PMC4982468

Article PubReader PDF–1.3MCitation

Functional prediction of differentially expressed lncRNAs in HSV-1 infected human foreskin fibroblasts

Benxia Hu, Yongxia Huo, Guijun Chen, Liping Yang, Dongdong Wu, Jumin Zhou

Virol J. 2016; 13: 137. Published online 2016 Aug 5. doi: 10.1186/s12985-016-0592-5

PMCID:

PMC4974703

Article PubReader PDF–1.4MCitation

Cellular responses to HSV-1 infection are linked to specific types of alterations in the host transcriptome

Benxia Hu, Xin Li, Yongxia Huo, Yafen Yu, Qiuping Zhang, Guijun Chen, Yaping Zhang, Nigel W. Fraser, Dongdong Wu, Jumin Zhou

Sci Rep. 2016; 6: 28075. Published online 2016 Jun 29. doi: 10.1038/srep28075

PMCID:

PMC4926211

Article PubReader PDF–2.1MCitation

Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response

Ming-Kun Liu, Jhe-Jhih Lin, Chung-Yung Chen, Szu-Cheng Kuo, Yu-Ming Wang, Hong-Lin Chan, Tzong Yuan Wu

Int J Mol Sci. 2016 Jun; 17(6): 931. Published online 2016 Jun 14. doi: 10.3390/ijms17060931

PMCID:

PMC4926464

Article PubReader PDF–5.0MCitation

ICP8 Filament Formation Is Essential for Replication Compartment Formation during Herpes Simplex Virus Infection

Anthar S. Darwish, Lorry M. Grady, Ping Bai, Sandra K. Weller

J Virol. 2016 Mar 1; 90(5): 2561–2570. Prepublished online 2015 Dec 16. Published online 2016 Feb 11. doi: 10.1128/JVI.02854-15

PMCID:

PMC4810729

Article PubReader PDF–3.4MCitation

H2AX phosphorylation and DNA damage kinase activity are dispensable for herpes simplex virus replication

Carolyn Botting, Xu Lu, Steven J. Triezenberg

Virol J. 2016; 13: 15. Published online 2016 Jan 27. doi: 10.1186/s12985-016-0470-1

PMCID:

PMC4728825

Article PubReader PDF–644KCitation

Selective Recruitment of Nuclear Factors to Productively Replicating Herpes Simplex Virus Genomes

Jill A. Dembowski, Neal A. DeLuca

PLoS Pathog. 2015 May; 11(5): e1004939. Published online 2015 May 27. doi: 10.1371/journal.ppat.1004939

PMCID:

PMC4446364

Article PubReader PDF–10MCitation

Selective recruitment of host factors by HSV-1 replication centers

Feng-Chao LANG, Xin LI, Olga VLADMIROVA, Zhuo-Ran LI, Gui-Jun CHEN, Yu XIAO, Li-Hong LI, Dan-Feng LU, Hong-Bo HAN, Ju-Min ZHOU

Dongwuxue Yanjiu. 2015 May 18; 36(3): 142–151. Published online 2015 May 18.

PMCID:

PMC4790689

Article PubReader PDF–11MCitation

HSV-I and the cellular DNA damage response

Samantha Smith, Sandra K Weller

Future Virol. Author manuscript; available in PMC 2016 Feb 1.

Published in final edited form as: Future Virol. 2015 Apr; 10(4): 383–397. doi: 10.2217/fvl.15.18

PMCID:

PMC4508672

Article PubReader PDF–655KCitation

Vuoden 2016 väitöskirja herpes-1 viruksesta

Title: Herpes Simplex Virus 1 DNA replication and its role in recombination and transcription Authors: Tang, Ka-Wei 

http://hdl.handle.net/2077/40883

I. Olsson M, Tang KW, Persson C, Wilhelmsson LM, Billeter M, Elias P. Stepwise evolution of the herpes simplex virus origin binding protein and origin of replication. J Biol Chem. 2009 Jun 12;284(24):16246-55. VIEW ARTICLE II. Tang KW, Norberg P, Holmudden M, Elias P, Liljeqvist JÅ. Rad51 and Rad52 are involved in homologous recombination of replicating herpes simplex virus DNA. PLoS One. 2014 Nov 3;9(11):e111584. VIEW ARTICLE III. Tang KW, Zhao ZY, Samuelsson T, Elias P. Replication-dependent expression of herpes simplex virus 1 late genes is controlled by P-TEFb and SIF. Manuscript

Date of Defence:

2016-01-22

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is one of nine different herpesvirus infecting man. They are all capable of establishing a life-long latent state following the primary infection. HSV-1 as well as other herpesviruses may reactivate from the latent state and give rise to a productive infection with clinical symptoms or asymptomatic shedding. HSV-1 infections are primarily treated by targeting the viral DNA replication carried out by a molecular machinery, a replisome, encoded by the virus.

Here we examine the mechanism of initiation of viral DNA replication and also how viral DNA replication interacts with DNA recombination and gene expression.

 In our first study we examined the initiation-step of HSV-1 replication. The origin binding protein (OBP) initiates replication by binding to the origin of replication (oriS and/or oriL). We showed, using phylogenetics and biochemical experiments, that there was a step-wise evolutionary development of herpesvirus DNA replication initiation.

The initial divergence was seen in herpesviruses acquiring an amino-acid motif RVKNL in OBP which binds the sequence TTCGCAC in the oriS. The next step was the development of an ICP8 binding motif at the C-terminus of OBP and finally the arrangement of the binding-sites for OBP in the oriS-sequence and the ability to form a stable hairpin.

 We presented molecular in vitro data to support the phylogenetic analysis and thereby defining essential motifs in OBP for protein-protein and protein-DNA interactions.

The next study was focused on genetic recombination between different HSV-1 strains. We followed the propagation of HSV-1 in cells infected with one to three genotypes of HSV-1 and calculated the number of recombination events. We found evidence for Rad51 and Rad52 involvement in recombination of the unique long and unique short gene segments of HSV-1.

 We also observed an increased recombination rate in cells with retarded ligation of Okazaki-fragments. The fidelity of recombination in virus propagated through mixed infections appears to be high since expansion or shortening of repeated sequences in the US7 gene was not detected.

 In the third study we examined the replication-coupled transcription of HSV-1 late genes, which are known to depend on DNA replication for efficient expression. Using chromatin immuno-precipitation we could determine that recruitment of RNA polymerase II to late gene promoters occur even in the absence of replication. Recruitment was dependent on ICP4, but delayed in comparison with early gene promoters. These observations suggested the involvement of transcription elongation and/or maturation in the expression of gamma genes.

 By using the drug DRB, which inhibits the kinase CDK9, a component of the positive transcription elongation factor B, and siRNA against Spt5, a transcription processivity factor, we could show a specific impairment of late gene expression, with only minimal effect on early gene expression and DNA synthesis.

We suggest that CDK9 and Spt5 are specifically recruited to replicated late genes and mediate a maturation of transcribed mRNA for nuclear exit.

 In summary, we have studied essential molecular processes in the HSV-1 life cycle and identified molecular interactions as well as mechanistic pathways, which may serve as future drug targets.

HIV-1.stä vuodelta 2005 , suomennos päivityksessä

Tässä päivityksessä jaan kaikki kappaleet eri osiin, koska tämä on vaikea asia.

INTRASELLULAARINEN IMMUNITEETTI HIV-1 VIRUSTA KOHTAAN (2005)

LÄHDE : Zheng Y-H, Peterlin BM. Intracellular immunity to HIV-1: newly defined retroviral battles inside infected cells Yong-Hui Zheng and B Matija Peterlin Retrovirology 2005, 2:25 doi:10.1186/1742-4690-2-25 Departments of Medicine, Microbiology and Immunology, Rosalind Russell Arthritis Research Center, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, 94143-0703, USASisältö

1. ABSTRAKTI

2. TAUSTA

3. INTERFERENSSI ja RESTRIKTIO

4. CYTIDIINIDEAMINAASIT

5. APOBEC-PROTEIINIT ja VIRUKSEN REPLIKAATIO

6. Vif JA APOBEC- PROTEIINIT

7. Vif-puuttteiste VIRUKSET ja LIIKKUVAT GENEETTISET ELEMENTIT ( RETROTRANSPOSONIT)

8. MUUT ANTIVIRAALIT GEENIT INTRASELLULAARISESSA IMMUNITEETISSA

9. SOLUNSISÄINEN IMMUNITEETTI

10 JOHTOPÄÄTÖS. YHTEENVETO

Abstrakti _ Abstract

Eukaryoottinen biologia ja immunologia on jatkuvasti rikastunut niistä tutkimuksista, joita HIV-1 viruksen suhteen suoritetaan (Human Immunodeficiency Virus - I). Nykytutkimuksissa on määritelty sellaisia tekijöitä, jotka alkavat toimia, kun virus on mennyt sisälle soluun (viral entry, decouting) ja ne estävät proviruksen replikaatiota infektoituneessa solussa. Eräät näistä järjestelmistä hyökkäävät suoraa viruksen rakenteitten kimppuun, kun taas toiset editoivat (manipuloivat) viruksen geneettistä materiaalia käänteisen kopioinnin aikana. Yhdessä ne muodostavat vahvan ja heti ehtivän intrasellulaarisen immuniteetin sisääntunkeutuvia patogeeneja kohtaan. Nämä prosessit tarjoavat myös kiinnostusta herättävän näkökulman fundamentaalisiin solumekanismeihin, jotka saattanevat asettaa rajoituksia ( restriktiota) liikkuvalle geneettiselle materiaalille, retrotransposoneille, ja täten suojata genomia.

SITAATTI. Studies of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) continue to enrich eukaryotic biology and immunology. Recent advances have defined factors that function after viral entry and prevent the replication of proviruses in the infected cell. Some of these attack directly viral structures whereas others edit viral genetic material during reverse transcription. Together, they provide strong and immediate intracellular immunity against incoming pathogens. These processes also offer a tantalizing glimpse at basic cellular mechanisms that might restrict the movement of mobile genetic elements and protect the genome.

1. TAUSTA_Background

1.1.Soluun perustuva yhteensopimattomus

Vaikkakin HIV-1 on mitä patogeenisin ihmiskunnassa, se ei kuitenkaan pysty replikoitumaan useimmissa muissa lajeissa. Tämä ihmishakuiuus, ihmis-trooppisuus, määräytyy pääasiallisesti siitä, omaako isäntäsolu tarvittavat kofaktorit (cofactors). Esim HIIRELTÄ puuttuu funktionaalinen reseptori ja soveltuva käänteiskopiointilaitteisto, joten hiiren soluissa ei toimi HIV-1 virusinfektio. Täten hiiren organismi pystyy vastustamaan patogeenia solun ja kudoksen yhteensopimattomuuden takia (incompatibility).

1.1. SITAATTI. Cell-based incompatibility Although it is highly pathogenic in humans, HIV-1 cannot replicate in most other species. This tropism is determined primarily by whether host cells express the required cofactors. For example, by lacking a functional receptor and appropriate transcriptional machinery, mouse cells do not support infection by HIV-1. Thus, the organism resists the pathogen via a cell-based incompatibility.

1.2. Nopea intrasellulaarinen immuniteetti

Mutta patogeenia voi rajoittaa myös jonkin hallitsevien inhibitoristen tekijöitten läsnäolo. Ne hyökkäävät soluun tunkeutuvan viruksen kimppuun heti ja blokeeraavat sen integroitumisen isäntägenomiin. Tämä pätee myös HIV-1 virukseen HIIREN soluissa ja edustaa todellista ”intrasellulaarista immuniteettia”. Mikä erittäin tärkeää, tällainen isäntäsoluvaste on paljon nopeampi kuin mikään traditionaalinen luonnollisen ( innate) tai adaptiivisen (adaptive) immuniteetin ( immunity) vaste ja se pystyy estämään solun infektoitumista.

1.2.SITAATTI. Rapid immediate intracellular immunity However, a pathogen can also be restricted by the presence of dominant inhibitory factors. They attack the incoming virus directly and block its integration into the host genome. This situation also pertains to HIV-1 in mouse cells and represents true "intracellular immunity." Importantly, this host response is more rapid than either traditional innate or adaptive immunity and can prevent the establishment of the infection._

1.3. TRIM5alfa perhe ja APOBEC-perhe ym

Intrasellulaarisesta immuniteetista hankittuun uuteen ymmärtämykseen kuuluu myös tieto kahdesta proteiinistaperheestä TRIM5alfa-perhe ja APOBEC-perhe. TRIM5alfa tarkoittaa ”the tripartite motif protein 5 alfa” ja APOBEC tarkoittaa ” the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptides 3B, 3C and 3G. (APOBEC3B, APOBEC3F and APOBEC3G or A3B, A3F and A3G). Kollektiivisesti nämä pystyvät inaktivoimaan useita retroviruksia, joihin kuuluu myös HIV-1, SIV ( simian immunodeficiency virus), hepatitis B virus HBV ja eräitä hiiren mobiileja geneettisiä elementtejä. Tässä artikkelissa katsahdetaan näihin viimeaikaisiin tietoihin ja mainitaan lyhyesti joitain muitakin seikkoja, mitkä ovat retroviraalista replikaatiota blokeeraavia.

2.3. SITAATTI. TRIM5alfa, ABOPEC families etc. Recent advances in our understanding of intracellular immunity have identified two different proteins, the tripartite motif protein 5α (TRIM5α) and the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic-polypeptides 3B, 3F and 3G (APOBEC3B, APOBEC3F and APOBEC3G or A3B, A3F and A3G), which collectively inactivate several retroviruses including HIV-1, simian immunodeficiency virus (SIV), hepatitis B virus and some mouse mobile genetic elements .This review highlights these recent developments and mentions briefly additional potential blocks to retroviral replication.

2. Interferenssi ja restriktio_ Interference and Restriction

2.1. Luonnollinen interferenssi. Fv (Friend virus susceptibility factor)

2.1Puuttuva reseptori.

Ensin määrittelyä ja taustaa. Virukesn ”interferenssillä” tarkoitetaan tilannetta, missä yhdellä viruksella kroonisesti infektoituneet solut tai endogeenistä retrovirusta sisältävät solut pystyvät vastustamaan (resist) superinfektiota, joita muut sellaiset virukset aiheuttavat, jolla on ulkovaipassaan (envelope) samanlaisia kohdespesifisyyksiä (target specificity). Tämän laadun estettä (block) aiheuttaa tavallisesti sopivan reseptorin puute solun pinnasta.

Hyvä esimerkki tästä on Fv4, Friend virus susceptibility factor 4 (tai Akvr-1), mikä kontrolloi HIIREN alttiutta ekotrooppiselle MLV-virukselle ( murine leucemia virus). Tämä geeni sijaitsee HIIREN kromosomissa 12 endogeenin, defektin proviruksen sisällä ja koodaa täydellistä kalvoa (envelope), jossa on hyvin suuri sekvenssien samankaltaisuus verrattuna Cas-Br-E virukseen ja Moloney MLV-virukseen. Tämä pintakalvo sitten blokeeraa kationi-aminohappokuljettajan ilmentymän, mikä taas toimii reseptorina MLV-viruksille solun pinnalla. MLV taas voi käyttää vain hiiren reseptorimuotoa, mutta ei ihmisen reseptorimuotoa.

2.1. SITAATTI. Loss of receptor. Let us begin with some definitions and historical perspectives. Viral "interference" refers to the situation when cells, which are chronically infected with one virus or contain endogenous retroviruses, resist superinfection by other viruses bearing envelopes with a similar target specificity. This block usually results from the loss of the appropriate receptor on the cell surface.A good example of this interference is the Friend virus susceptibility factor 4 (Fv4), also known as Akvr-1, which controls the susceptibility of mice to infection by ecotropic but not other murine leukemia viruses (MLVs). This gene is located on mouse chromosome 12 within an endogenous defective provirus and encodes a complete envelope that shares very high sequence similarity with those from ecotropic Cas-Br-E virus and Moloney MLV. This envelope then blocks the expression of the cationic amino acid transporter, which is the receptor for these MLVs, on the cell surface. Of interest, MLV can only use the murine but not the human form of this receptor for entry.

2.2. Restriktio. Fv1 järjestelmä

2.2. Fv

”Restriktiolla” taas viitataan virusreplikaation intrasellulaariseen blokeerautumiseen Tästä on näihin asti ollut parhampana esimerkkinä Fv1. Kuten Fv4 ja vähemmän karakterisoidut Fv3 ja Fv2, niin myös Fv1 aiheuttavat HIIRELLÄ resistenssiä MLV-infektiota vastaan.

Fv1 geeni sijaitsee HIIRELLÄ kromosomissa 4 ja koodaa proteiinia, joka muistuttaa muita endogeenejä, retroviraaleille struktuuriryhmille spesifisiä antigeenejä. Tässä huomautetaan, että virionien morfogeneesissä ja vapautumisessa retroviraali Gag -polyproteiini prosessoituu virusproteaasilla eri alayksikköihinsä kuten matriksi MA ja kapsidi CA sekä nukleokapsidi NC. Kun MA ja CA muodostavat matriksikuoren ja kotelon ytimen kypsiä viraalisia partikkeleita, niin NC pakkaa viruksen genomista RNA:ta ydinkotelon sisään. Kun virus taas menee uuteen soluun infektoimaan ja on sen sisällä ( ENTRY) ja alkaa vapautua ulkovaipastaan ( ENVELOPE, UNCOUTING), moni rakenneproteiini jää liittyneeksi viruksen entsyymeihin (kuten RT , reverse transcriptase ja IN, integrase) ja RNA:han laajassa preintegraatiokompleksissa PIC (koko 2 mDa)

2.2. SITAATTI. The term "restriction" refers to intracellular blocks to viral replication. Until now, the best example has been Fv1. Like Fv4 and the less well-characterized Fv3 and Fv2, Fv1 also confers resistance of mice to the infection by MLV. The Fv1 gene is located on mouse chromosome and encodes a protein that resembles other endogenous retroviral structural group specific antigens (Gag). Of note, during the morphogenesis and release of progeny virions, retroviral Gag polyproteins are processed by the viral protease into distinct subunits, namely matrix (MA), capsid (CA) and nucleocapsid (NC). Whereas MA and CA form the outer shell and inner core of mature viral particles, NC packages viral genomic RNA into the core. After entry and uncoating in newly infected cells, many structural proteins remain associated with viral enzymes (reverse transcriptase, RT and integrase, IN) and RNA in a large (2 mDa) preintegration complex (PIC).

2.3 Blokeeraus, Fv1 ja kapsidi CA, PIC

Fv1 alleellit Balb/c ja NIH/Swiss HIIRISSÄ johtavat resistenssiin MLV viruksen N- ja B-trooppisia kantoja kohtaan (vastaavasti), mitkä kartoittuvat kapsidirakenteen CA asemaan 110. Viimeiset rakenneanalyysit ovat paljastaneet että tämä aminohappotähde sijaitsee kotelorakenteen ulkopinalla CA-molekyylissä, mikä on helposti soluproteiinien tavoitettavissa. Fv1:ssä avainaminohappo tälle restriktiolle kartoittui asemaan 358, vaikka ei ole demonstroitu sitoutumista Fv1 ja CA kesken, ne voivat jollain tavalla olla interaktiossa, erityisesti kun CA ja Gag muodostavat oligomeerejä, CA:n tapauksessa viruskotelon hexagonaalisia ristikoita. Koska heterozygoottinen Fv1n/b blokeeraa infektion molemmista viruksista käsin, resistenssi on dominanttia. Toisaalta N/B- trooppinen MLV virus voi infektoida kaikkia näitä hiiriä. Tämä restriktio on saturoituvaa molemmista viruksista peräisin olevilla kapsidien CA suurilla pitoisuuksilla, mikä merkitsee että Fv1 määrät tai sen kofaktoreitten määrät ovat rajoittavia. Kuten alla kerrotaan, yksi näistä cofaktoreista voi olla TRIM5alfa. Näitten interaktioitten tuloksena oletetaan, että Fv1 blokeraa CA (ydinkapsidin) hajaantumisen ja PIC-kompleksin normaalin liikkumisen tumaan.

2.3.. SITAATTI. Alleles of Fv1 in Balb/c (Fv1^b/b) and NIH/Swiss (Fv1^n/n) mice result in resistance to N- and B-tropic strains of MLV, respectively, which maps to position 110 in CA. A recent structural analysis revealed that this residue is located at the outer face of the core structure of CA with easy access to cellular proteins. On Fv1, the key residue for this restriction was mapped to position 358. Although binding between CA and Fv1 has not been demonstrated, they could interact as higher order structures, especially since CA and Gag form oligomers, in the case of CA, hexagonal lattices of the viral core. As heterozygous Fv1^n/b mice block infection by both viruses, resistance is dominant.Conversely, NB-tropic MLV can infect all these mice. Of interest, this restriction is saturable with high levels of CA from either virus, implying that amounts of Fv1 or its cofactor/s are limiting. As described below, one of these cofactors could be TRIM5α. As a result of these interactions, Fv1 is thought to block the disassembly of CA and the normal movement of the PIC into the nucleus.

3. Retroviraalinen TRIM5α järjestelmä

3.1. Intrasellulaarista immuniteettia on muutakin kuin Fv1

Fv1 ei ole ainoa geneettinen järjestelmä, mikä suo intrasellulaarista immuniteettia retroviraalista infektiota kohtaan. Esimerkiksi N-trooppisen MLV-viruksen replikaatio ja EIAV -lentiviruksen (hevosen infektiöösin anemian viruksen) replikaatio on inhiboitunut ihmissoluissa. Samoin nisäkkään lentiviruksista HIV-1:n ja rhesusapinan SIVmac-viruksen replikaatiot ovat estyneet eri apinalajien soluissa. ESIM. HIV-1 ei pysty kasvamaan vanhan maailman apinain soluissa ja näihin kuuluvat African green monkeys (agm)ja Rhesus macaques-apinalajit (mac). SIVmac ei taas pysty infektoimaan uuden maailman apinoita, joihin kuuluu squirrel monkey, orava-apinat ja common marmoset, kynsiapinat.

3.1. SITAATTI Fv1 is not the only genetic system conferring intracellular immunity against a retroviral infection. For example, the replication of N-tropic MLV and the equine infectious anemia virus (EIAV, a lentivirus) is also inhibited in human cells, as is that of the primate lentiviruses HIV-1 and SIV from rhesus macaques (SIV_mac) in cells from different monkeys. For example, HIV-1 does not grow in old world monkeys, which include African green monkeys and rhesus macaques, and SIV_mac does not infect new world monkeys, which include squirrel monkeys and common marmosets.

3.2. Miten Lv1 ja Ref 1 blokeeraukset muistuttavat Fv1-restriktiota?

Ensinnäkin: Viruksen replikaatio epäonnistuu käänteiskopiointikohdilta.

Toiseksi, CA kapsidiproteiini on myös kohteena (target). Kapsidiproteinin CA aseman 110 aminohappo myös määrää N-trooppisen MLV:n restriktion ihmissolussa. HIV-1 viruksen restriktio rhesus macaque -apinan solussa kumoutuu, jos sen CA ( kapsidiproteiini) korvataan SIVmac CA-proteiinilla.

Kolmanneksi: Koska inhibitiota non-restriktiivisen ja restriktiivisen solun välillä ylläpitää heterokaryon, tämä restriktio on dominantti.

Lopuksi: Nämä blokit ovat saturoitavissa.

Kuitenkin koska mitään Fv1-geeniin verrattavaa geeniä ei löydy nisäkässoluista, ihmissoluissa tapahtuva blokeerautumisen N-trooppiselle MLVvirukselle ja EIAV lentivirukselle on oletettu johtuvan restriktiofaktorista 1 (Ref 1) ja apinansoluissa esiintyvä blokeerautuminen HIV-1 ja SIV-1 viruksille katsotaan johtuvan lentivirukselle alttiusfaktorista Lv1 ( lentivirus susceptibility factor 1)

3.2. SITAATTI. Interestingly, these blocks resemble Fv1 restriction in several ways. First, viral replication is impaired at the step of reverse transcription . Second, CA is also targeted. The residue at position 110 in CA also determines the restriction of N-tropic MLV in human cells and that of HIV-1 in rhesus macaque cells is abrogated when its CA is replaced by that from SIVmac.

Third, because heterokaryons between non-restrictive and restrictive cells maintain the inhibition, this restriction is dominant. Finally, these blocks are saturable. However, since no Fv1-related gene could be found in primate cells, blocks to N-tropic MLV and EIAV in human cells were thought to be due to the restriction factor 1 (Ref1), and those to HIV-1 and SIV in monkey cells to the lentivirus susceptibility factor 1 (Lv1).

3.3. TRIM5alfa geeni. Mitokondriaalinen integriteetti tärkeä.

Todellakin Ref1 ja Lv1 näyttivät omaavan toisiaan lisääviä samankaltaisuuksia blokeeratessaan retroviraalisia replikaatioita. Esimerkiksi molemmat restriktiot poistuvat, jos mitokondriaalisten kalvojen integriteetti särkyi kemiallisesti. Nämä ovat myös saturoitavissa samoilla virusten kaltaisilla partikkeleilla. Kun käytettiin funktionaalista komplementtimenetelmää, Lv1 identifioitiin ensiksi rhesus macaque -apinan TRIM5alfa geeninä (macTRIM5alfa). Myöhemmin kun eliminoitiin TRIM5alfa transkripteja vanhan maailman apina-ja ihmissoluista siRNA interferenssillä, katosi samalla Lv1 ja Ref1 blokeeraukset. Tutkimukset osoittivat, että hTRIM5 alfa, macTRIM5alfa ja agmTRIM5alfa ( African green monkey) pystyvät tekemään sellaisen restriktion eri viruksille, mitä aiemmin oli katsottu Lv1 ja Ref1 funktioiksi. Niinpä Lv1 ja Ref 1 on katsottava lajispesifisiksi TRIM5alfa varianteiksi.

3.3. SITAATTI. Indeed, Ref1 and Lv1 share additional similarities in blocking retroviral replication. For examples, both restrictions can be attenuated by chemicals that disrupt the integrity of mitochondrial membranes, and they can be saturated by the same virus like particles (VLPs). Using a functional complementation assay, Lv1 was first identified as the rhesus macaque TRIM5α (macTRIM5α) gene. Later, by eliminating TRIM5α transcripts from old world monkey and human cells with small interfering RNA (siRNA), the Lv1 and Ref1 blocks were also abrogated. Further studies revealed that hTRIM5α (from humans), macTRIM5α and agmTRIM5α (from African green monkeys) restrict the replication of different viruses, which were assigned previously to Lv1 and Ref1 .Thus, Ref1 and Lv1 are species-specific variants of TRIM5α.

3.4. Ihmisen hTRIM5alfa proteiini, TRIM5 geenit. RBCC rakenne

Ihmisen TRIM5alfa proteiinissa on 493 aminohappotähdettä ja se kuuluu suureen tripartiittimotiiviperheeseen, jossa on 37 geeniä. Niihinluetaan PML tai TRIM19 geeni

( promyelosyyttileukemiaproteiini). Kun ne käyttävät vaihtoehtoista RNA-pilkkoutmista ne voivat tuottaa 71 eri transkriptia. Esimerkiksi ihmisen TRIM5 geeniä hTRIM5α, β, γ, σ, ε, ja ζ..

Vaikka niitten funktiosta on vain vähän tietoa, tiedetään että niillä on rakenteessaan kolme selvää motiivia

RING Zn++finger,

yksi tai kaksi kappaletta B-box Zn++finger

ja yksi alfa-helix-hair pin (CC, coiled coil) alue.

Tämän takia niitä kutsutaan myös nimellä: RING finger:B box:Coiled Coil (RBCC) family proteins. Tämä RINGfingermotiivi sisältää cysteiiniä runsaasti ja siihen kuuluu kaksi toisiaan vastaan välilehtimäisesti sijaitsevaa sinkkiä sitovaa kohtaa. Monet RING-finger proteiineista toimivat kuten E3 ubikitiiniligaasi ja niillä on avainosuutta proteiinien hajoittamisessa (silppuroimisessa).

ESIM: Ring-box-1 (Rbx1) on essentielli komponentti sellaisessa kompleksissa, jonka nimi on SCF ( Skp1:cullin-1:F-box).

Lisäksi TRIM5σ osoittaa E3 ligaasin aktiivisuutta koeputkessa.

3.4. SITAATTI. The hTRIM5α protein contains 493 residues and belongs to the large tripartite motif (TRIM) family that consists of 37 genes, which include the promyelocytic leukemia (PML or TRIM19) protein. By alternative RNA splicing, they produce 71 different transcripts. For example, the human TRIM5 gene is expressed as hTRIM5α, β, γ, σ, ε, and ζ. Although little is known of their function, they contain three distinctive structural motifs, a RING Zn⁺⁺ finger, one or two B-box Zn⁺⁺ finger, and an α-helical coiled-coil (CC) region. For this reason, they are also called the RING finger:B box:Coiled-coil (RBCC) family proteins. The RING finger motif features a cysteine-rich consensus, which contains two interleaved Zn⁺⁺-binding sites. Many RING finger proteins act as E3 ubiquitin ligases and play key roles in protein degradation. For example, Ring-box-1 (Rbx1) is an essential component of the Skp1:cullin-1:F-box (SCF) complex. Additionally, TRIM5σ displays E3 ligase activity in vitro [38].

3.5. TRIM-proteiinien sijainti solussa. B-Boxit. TRIM19 (PML). SPRY.

B-boxit, joissa on yksi Zn++ sitova kohta ja B1 ja B2 motiivit, orientoivat hairpin (CC) motiivia, joka välittää proteiini-proteiini-interaktioita.

Itseasiassa TRIM proteiinit muodostavat oligomeereja.

Lisäksi TRIM 5alfa sisältää SPRY domaanin C-terminaalissaan. Tämä domaani identifioitiin ensiksi sp1A- kinaasina Dictyosteliumista ja kaniinin ryanodiinireseptorista ja se kuuluu B30.2 alaluokkaan tai RFP-kaltaiseen domaaniin. Butyrofiliinissa B30:2 domaani, jossa on 170 tähdettä, osallistuu ligandin sitomiseen.

TRIM-proteiinit lokalisoituvat erityisiin soluaitioihin, joissa ne muodostavat erillisiä rakenteita. Kun TRIM19 kertyy erillisiin PML-onkogeenisiin domaaneihin (PODs) tumassa, niin TRIM5alfa voi muodostaa sytoplasmisia rakenteita ( cytoplasmic bodies).

3.5. SITAATTI. B-boxes, which consist of one Zn⁺⁺-binding site and a B1 or B2 motif, orient the CC motif that mediates protein-protein interactions. Indeed, TRIM proteins form oligomers.In addition, TRIM5α contains a SPRY domain at its C-terminus. The SPRY domain was originally identified in the splA kinase of Dictyostelium and the rabbit ryanodine receptor, and belongs to the subclass of the B30.2 or RFP-like domains. In butyrophilin, the B30.2 domain, which contains 170 residues, is involved in ligand binding. Of interest, TRIM proteins localize to particular cellular compartments where they form discrete structures. Whereas TRIM19 assembles discrete PML oncogenic domains (PODs) in the nucleus, TRIM5α can form cytoplasmic bodies.

3.6. Ihmisille vaikea mutaatio tapahtunut V1/SPRY R332P

Vaikka TRIM proteiineilla on 87 % sekvenssisamankaltaisuus, niin vain macTRIM5alfa ja hTRIM5alfa voivat blokeerata HIV-1 replikaatiota. Tämä lajispesifinen restriktio kartoitettiin SPRY-domaaniin. Geneettisesti analysoiden saatiin ilmi, että SPRY-domaani on dramaattisesti mutatoitunut nisäkkäitten evoluution aikana ja sisältää neljä variabeli aluetta V1, V2, V3 ja V4. Yhden yksittäisen aminohapon muutos (R332P) variabelissa V1 kumoaa HIV-1 viruksen replikaatiota estävän vaikutuksen, mikä hTRIM5alfalla voisi olla. Tästä voidaan päätellä, että SPRY-domaani on vastuullinen kapsidiproteiiniin CA-kohdistumiseen. Vaikka ei ole demonstroitu sitoutumista rhTRIM5alfa SPRY-domanin ja HIV-1 CA kapsidiproteiinin välillä, kuitenkin pöllöapinalta ( owl monkey) tehdyt löydöt omTRIM5alfan suhteen viittaisivat sellaiseen suoraan interaktioon.

Nyt seuraa aika monimutkainen kertomus selitykseksi.

3.6.SITAATTI Although they share 87 % sequence similarity, only macTRIM5α but not hTRIM5α blocks HIV-1 replication. This species-specific restriction was mapped to the SPRY domain. Through genetic analysis, it was revealed that this SPRY domain has experienced dramatic mutations during primate evolution and contains four variable regions V1, V2, V3, and V4. The change of a single residue (R332P) in V1 abolished the inhibition of HIV-1 replication by hTRIM5α , which suggests that the SPRY domain is responsible for its targeting of CA. Although no binding between the SPRY of rhTRIM5α and HIV-1 CA has been demonstrated, the findings with TRIM5α from owl monkeys (omTRIM5α) support such direct interactions.A rather complicated story follows.

3.7. Kertomus Cyclophilinin osuudesta ja johtopäätöksistä

Cyclofiliini A (CypA) on eukaryoottinen peptidyyliprolyyli cis-trans-isomeraasi. Se sitoutuu proliinirikkaaseen ulokelenkkiin HIV-1 kapsidiproteiinissa CA ja se on kriittinen viruksen replikaatiolle ihmisen soluissa. Mutta pöllöapinan soluissa asia on päinvastoin: kyky sitoutua CypA-molekyliin on restriktio HIV-1 viruksen replikaatiolle.

Pöllöapinat ovat atyyppisiä uuden maailman apinoita, koska niitten Lv1 estää HIV-1, mutta ei SIVmac virusta. Vaikkakin tämä blokki HIV-1 replikaatiolle kumoutuu, kun interaktio CA-kapsidiproteiinin ja CypA kesken estetään CA-mutaatiolla tai syklosporiini A-käsittelyllä pöllöapinassa, sama manipulaatio lisää Ref1 efektiä HIV-1 virukseen ihmissoluissa. Selitykset näihin eroihin saatiin, kun kloonattiin omTRIM5alfa geeniä.

SPRY domaanin sijasta se sisältää täydellisen CypA geenin. Täten pöllöapinan solut ilmentävät fuusioproteiinia omTRIM5alfan ja CypA.n kesken ( omTRIM5alfaCypA), mikä todennäköisimmin saa alkunsa CypA geenin retrotranspositiosta omTRIM5alfa lokukseen pitkällä sekaan sirottautuneella tumaelementti-1:llä ( LINE-1 tai LI). Johtopäätöksenä on, että CA ja omTRIM5alfa ovat keskinäisessä vuorovaikutuksessa tämän CypA domaanin välityksellä ja aiheuttavat restriktiota HIV-1 replikaatiolle pöllöapinoissa.

SITAATTI 3.7. Cyclophilin A (CypA) is an eukaryotic peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase. It binds an exposed proline-rich loop in CA of HIV-1 and is critical for its replication in human cells. In contrast, the ability to bind CypA restricts HIV-1 replication in owl monkey cells. Owl monkeys are atypical new world monkeys because their Lv1 inhibits HIV-1 but not SIV_mac. Although this block to HIV-1 replication is abrogated when the interaction between CA and CypA is prevented by mutations in CA or by cyclosporin A treatment in owl monkey cells, the same manipulations increase effects of Ref1 on HIV-1 in human cells. The explanation for these differences came with the cloning of the omTRIM5α gene. Instead of the SPRY domain, it contains the complete CypA gene. Thus, owl monkey cells express a fusion protein between omTRIM5α and CypA (omTRIM5α.Cyp), which most likely arose from a retrotransposition of the CypA gene into the omTRIM5α locus by the long interspersed nuclear elements-1 (LINE-1 or L1). In conclusion, CA and omTRIM5α interact via this CypA domain and restrict HIV-1 replication in owl monkeys.

3.8. Antiviraalit vaikutukset kohdistuvat viruksen ydinkoteloon (CA) tai tumaan kuljetukseen ( Nuclear entry)

Näistä tutkimuksista voisi olettaa, että Fv1 ja TRIM5alfa voisivat suoraan olla interaktiossa ydinkapsidiproteiiniin CA ja täten blokeerata soluun sisääntulevia viruksia. Kuitenkin, päinvastoin kuin Fv1, joka blokeeraa tumaan menoa ja proviruksen integraatiota, TRIM5alfa estää viruksen replikaatiota vaiheessa, joka on juuri ennen käänteiskopioimista. On hämmästyttävää, miksi tällaisia eroja esiintyy. Vastauksen ehkä havaitsee siitä, että MLV pidättää CA proteiinia liittyneenä käänteiskopiokompleksiinsa, mutta sitä ei tee HIV-1. Joten HIV-1:n vaipankuoriutuminen ( uncouting) saattaisi tapahtua nopeammin kuin MLV-viruksella. Heti, kun ydinkotelon (core) rakenne on tuhoutunut, voisi käänteiskopiokompleksi (RTC) tulla alttiimmaksi TRIM5alfa vaikutukselle. TRIM5alfa voisi silloin triggeröidä esiin PIC-kompleksin menon proteiinisilppuriin.

Tämä malli myös tarjoaa selitystä siihen, miksi viruksen replikaatio lisääntyy, kun kohdesoluja käsitellään proteosomaalisilla inhibiittoreilla. Edelleen tarvittaisiin lisätutkimuksia muista proteiineista, jotka ovat interaktiossa Fv1:n ja TRIM5alfan kanssa, niitten entsymaattisista ominaisuuksista ja niitten kulkeutumisista soluissa.

SITAATTI 3.8. These studies suggest that Fv1 and TRIM5α might interact directly with CA to block incoming viruses. However, in contrast to Fv1, which blocks nuclear entry and integration of the provirus, TRIM5α inhibits viral replication at a step before reverse transcription. It is puzzling why such differences exist. An answer might lie in the observation that MLV, but not HIV-1, retains its CA in the reverse transcription complex. Thus, the uncoating of HIV-1 could proceed much faster than that of MLV. Once the core structure is destroyed, the reverse transcription complex could become more susceptible to TRIM5α. TRIM5α could then trigger the proteasomal degradation of PIC. This model also offers an explanation of the enhancement of viral replication when target cells are treated with proteasomal inhibitors. Further details await studies of other proteins that interact with Fv1 and TRIM5α, their enzymatic properties and trafficking in cells.

4 Cytidine deaminases Cytosiinista(C) tulee deaminaatiossa urasiili (U)

4.1. Solun sytidiinideaminaasi tekee hypermutaatioita G-A

Isäntäsolut ovat kehittäneet myös lisämekanismeja suojautuakseen viruksilta- edellä mainitujen Fv1 ja TRIM5alfa lisäksi. Seuraavaksi tärkein on sellainen blokki, joka käsittää nukleiinihappojen editoimista käänteiskopioinnin aikana. ( DNA ja RNA ovat nukleiinihappoja). Jo kauan aikaa sitten on havaittu, että retrovirukset sisältävät suuren frekvenssin G-A transitioita (hypermutaatioita). Muutamissa HIV-1 kannoissa yli 60 % kaikista guanidiineista (G) korvautui adeniineilla(A). Aiemmin arveltiin, että tämä G-A hypermutaatio olisi (error prone) käänteiskopiointiin kuuluvaa korkeaa virhetiheyttä (error rate) ja epätasapainoa solun sisältämässä dCTP-altaassa. Mutta nyt kuitenkin tiedetään, että tämä johtuu solun sytidiinideaminaasin toiminnasta.

SITAATTI.4.1. In addition to Fv1 and TRIM5α, host cells have developed additional mechanisms to protect themselves from viral invasion. The next important block involves nucleic acid editing of viral reverse transcripts. For a long time, it had been noted that retroviruses contain a high frequency of G to A transitions. In certain strains of HIV-1, up to 60% of all guanidines (G) are replaced by adenines (A). Previously, this G to A hypermutation was attributed to the high error rate of reverse transcriptase and the imbalance in dCTP pools in cells. However, we now know that host cellular cytidine deaminases are responsible.

4.2. Antiviraalinen, inhibitorinen faktori A3G, A3F, A3B löytyy.

Samansuuntaisesti on havaittu, että mutantti HIV-1, jolta puuttuu infektiivisyysfaktori Vif ( HIV_1deltaVif), pystyy replikoitumaan vain tietyissä T-soluissa, joita sanotaan ”permissiivisiksi” soluiksi (replikaation salliviksi). Mutta muissa non-permissiivisissä soluissa vain wt ( wild type) HIV-1 (eikä HIV_1 delta Vif) saattaa lisääntyä. Koska permissiivisten ja non-permissiivisten solujen välinen heterokaryon ei tue HIV-1deltaVif replikaatiota, on jokin dominantti inhibiittori näissä non-permissiivisissä soluissa. Non-permissiivisten CEM ja permissiivisten CEM-SS T-solujen kloonaustutkimuksissa pystyttiin identifioimaan inhibitorinen faktori ihmisen A3G (hA3G) proteiinina. Myöhemmin löydettiin sen lähisukulainen hA3F ja heikompi hA3B, joilla löydettiin samanlaista antiviraalia aktiviteettia.

SITAATTI 4.2. In parallel, mutant HIV-1 lacking the viral infectivity factor (Vif) (HIV-1ΔVif) can only replicate in certain T cell lines, which are called "permissive" cells. In other "non-permissive" cells, only wild type HIV-1 but not HIV-1ΔVif can replicate. Because heterokaryons between permissive and non-permissive cells do not support the replication of HIV-1ΔVif, there exists a dominant inhibitor in these non-permissive cells. By subtractive cloning between non-permissive CEM and permissive CEM-SS T cells, the inhibitory factor was identified as the human A3G (hA3G) protein. Later, its close relatives hA3F, and to a lesser degree, hA3B, were found to possess similar anti-viral activities.

4.3. APOBEC perheen 10 proteiinia deaminoi nukleiinihappoa sytoplasmassa

APOBEC perheessä on 10 proteiinia ja niihin kuuluu perustavana jäsenenä APOBEC1 (A1) ja aktivaation indusoima deaminaasi (AID). Niillä on yksi tai kaksi sinkkiä (Zn++) sitovaa deaminaasimotiivia consensussekvenssissään His-X-Glu-X23-28-Pro-Cys-X2-4-Cys ( missä X on mikä tahansa aminohappo).

APOBEC1 ja AID omaavat yhden sinkkiä (Zn++) sitovan segmentin. hA3F ja fA3G omaavat kaksi sinkkiä ( Zn++) sitovaa segmenttiä.

Ne pystyvät kohdentamaan cytosiineihin (C) ja muuntamaan niitä urasiileiksim (U), mikä tekee C-U-transition (-) DNA:ssa tai RNA ( esim A1) templaatissa. Kun syntetisoituu toinen (+)DNA-säie, nämä C-U transitiot editoidaan silloin G-A emäsparina. Esimerkiksi jos C6666 muuttuu U6666:ksi, A1 tuottaa stop-kodonin asemaan 6666 apolipoproteiini B100 mRNA.ssa, mikä sitten translatoidaan typistettynä (truncated) apolipoproteiini B48 (48kDa) proteiinina.

AID pystyy suuntaamaan cytidiinideaminaatiota spesifisiin ”hot spot”-kohtiin aiheuttaen somaattisia hypermutaatioita ja isotyyppiluokkien vaihteluja B-soluissa. hA3F ja hA3G blokeeraavat retroviraalista infektiota hematopoieettisissa soluissa. Niissä on sekvensseissään 70 % samankaltaisuus ja ne muodostavat homodimeerejä ja sekaoligomeereja. Näiden proteiinien fysiologiset funktiot eivät ole vielä määritetyt, paitsi että hA3G myös estää soluissa eräitten hiiren mobiilien geneettisten elementtien ( retrotransposonien) liikettä. Täten ne voisivat osaltaan vaikuttaa genomin stabilisuutta.

4.3. SITAATTI. The human APOBEC family comprises 10 proteins, among which are the founding member APOBEC1 (A1) and the activation induced deaminase (AID). They contain one (e.g. APOBEC1 and AID) or two (e.g. hA3F and hA3G) Zn⁺⁺-binding deaminase motifs with the consensus sequence His-X-Glu-X_23–28-Pro-Cys-X_2–4-Cys (where X denotes any amino acid) . They can target cytosines and convert them to uracils (C to U transitions) on DNA or RNA (e.g. A1) templates. During the second-strand DNA synthesis, these C to U transitions are then converted to those of G to A. For example, by changing C6666 to U6666, A1 introduces a stop codon at position 6666 into the apolipoprotein B100 mRNA, which is translated into the truncated apolipoprotein B48 (48 kDa) protein. AID also directs the cytidine deamination at specific "hot spots" to direct somatic hypermutation and isotype class switching in B cells. hA3F and hA3G block retroviral infection in hematopoietic cells. They share overall 70% sequence similarity and form homodimers as well as mixed oligomers. Physiological functions of these proteins are not yet defined, except that hA3G also inhibits the movement of some mouse mobile genetic elements in cells. Thus, they could contribute to the stability of the genome.

5 APOBEC proteiinit ja retroviruksen replikaatio_ APOBEC proteins and viral replication

5.1 Urasiilia ja hypermutaatiota tekevä

On laajalti luonnehdittu ABOBEC-proteiinien antiviraalia ominaisuutta. Jos Vif tekijää ei ole viruksen puolelta, hA3F ja hA3G pystyvät inkorporoitumaan virioneihin. Tällä tavalla ne siirtyvät tuottajasolusta virionin mukana kohdesoluun. Kun virus menee kohdesoluun ( entry) tekemään uutta infektiota ja vapautuu ulkokerroksistaan ( uncouting), alkaa käänteiskopiointi ja viruksen (-) cDNA syntetisoituu. Tämän prosessin aikana nämä APOBEC-proteiinit hyökkäävät vastasyntyneen (-) cDNA:n kimppuun ja aiheuttavat siinä C-U transitioita, mikä voi blokeerata monella mekanismilla viruksen replikaatiota.

Ensinnäkin koska DNA ei siedä urasiilia (U), niitä irrotetaan UNG-järjestelmällä (urasiili-N-glykosidaasientsyymeillä) DNA:sta ja tämä nyhdetty DNA voidaan edelleen pilkkoa isäntäsolun DNA repair-järjestelmän (DNA korjausjärjestelmän) entsyymeillä kuten apuriini- tai apyridiini-endonukleaasilla ( abaasisen kohdan endonukleaasilla-1, APE1). Kun DNA on fragmentti, se ei enää integroidu eikä replikoidu.

Toiseksi, jos editoitu provirus kuitenkin selviää elossa ja pystyy integroitumaan, uusi G-A muutos DNA:n (+) säikeessä voi myös aiheuttaa viruksen transkriptin hävittämisen. Nämä muutokset voivat johtaa vaihtoehtoiseen pilkkoutumiseen ja funktionaalisesti epäkelpoihin tuotteisiin. hA3G ja gA3F omaavat tällaisiin päätteisiin erilaisia sekvenssimieltymyksiä. Kun hA3G suosii toistuvaa deoksicytidiiniä- (vastapäisessä säikeessä GG), niin hA3F suosii deoxycytidiinejä, joita seuraa deoxytymidiinit (GA) vastapäisessä säikeessä.

5.1. SITAATTI The mechanisms for antiviral activities of APOBEC proteins have been characterized extensively. In the absence of Vif, hA3F and hA3G are incorporated into virions. They are then transferred from producer to target cells by the virus. Following viral entry and uncoating, reverse transcription is initiated and viral minus-strand cDNA is synthesized. During this process, these APOBEC proteins attack newly synthesized minus-strand cDNAs and introduce C to U transitions , which block viral replication by several mechanisms. First, since uracils are not tolerated in DNA, they are removed by uracil N-glycosidases (UNG) from DNA and these nicked DNA are further cleaved by the host DNA-repair enzymes like apurinic/apyrimidinic endonuclease-1 (APE1). Fragmented DNA neither integrates nor replicates.

Second, should edited proviruses survive and integrate, the new G to A changes on the plus strand DNA also create havoc on viral transcripts. These changes could lead to alternate splicing and the production of nonfunctional proteins. To these ends, hA3G and hA3F have different sequence preferences. Whereas hA3G favors repeated deoxycytidines (GG on the opposite strand), hA3F prefers deoxycytidines followed by deoxythymidines (GA on the opposite strand).

5.2. Spesifisia antiviraaleja interaktioita

hA3G proteiinin avainaskel sen antiviraalisuudessa on sen inkorporoituminen virioniin mukaan. Vaikka hA3G vaatii HIV-1 Gag proteiinista NC-tekijää päästäkseen kapsidikoteloon, on edelleen ristiriitoja siinä, olisiko tämä interaktio RNA-välitteinen. Koska sekä NC että hA3G pystyvät sitomaan RNA:ta, tämä rekrytoiminen heijastaisi todennäköisimmin RNA-proteiini- ja myös proteiini-proteiini-interaktioita. Näillä interaktioilla lienee laajaa spesifisyyttä siitä huolimatta, koska hA3G blokeeraa replikaatiota kaikissa nisäkkäitten lentiviruksissa, jos Vif puuttuu ( HIV-1, HIV-2, SIV), EIAV ja HBV-viruksissa ja eräitä hiiren mobiileja geneettisiä elementtejä. Esimerkiksi hA3F omaa samaa vaikutusta HIV-2, SIV ja HBV viruksissa. hA3B ja hA3C blokeeraavat SIV. Mielenkiintoista on myös, että rotan A1, mutta ei ihmisen A1 proteiini blokeeraa HIV-1 suoraan deaminoimalla viruksen RNA:ta.

5.2. SITAATTI The key step for the anti-viral activity of hA3G is its incorporation into virions. Although the encapsidation of hA3G requires NC of HIV-1 Gag, it is still controversial whether this interaction is mediated by RNA. Since both NC and hA3G can bind RNA, this recruitment most likely reflects RNA-protein, as well as protein-protein, interactions. Nevertheless, since hA3G blocks the replication of all primate lentiviruses in the absence of Vif (HIV-1, HIV-2, and SIV), EIAV, HBV ,and some mouse mobile genetic elements, these interactions must have broad specificities. For example, hA3F has the same effect against HIV-1, SIV and HBV and hA3B and hA3C block SIV. Of interest, the rat but not human A1 proteins block HIV-1 by directly deaminating viral RNA.

6 APOBEC-proteiinit ja Vif_ Vif andAPOBEC proteins

6.1. Vif johdattelee solun antiviraaleja ja sytokiinisignaloinnin proteiineja silppuroitumaan

Päinvastoin kuin HIV-1deltaVif, wt-HIV-1( wild type) ei ole restriktiossa ”non-permisiivisissä” soluissa. Täten Vif vastavaikuttaa hA3F ja hA3G-proteiineihin.

Vif todella sitoo niitä ja triggeröi niiden hajoittamista viruksia tuottavassa solussa ja täten blokeeraa niitten inkorporoitumista mukaan virionpartikkeleihin.

Alunperin havaittiin, että Vif oli interaktiossa soluproteiiniin Cul5, elongiiniB, elongiiniC ja Rbx1 kanssa muodostaen culliini-perustaisen E3 ubikitiiniligaasi kompleksin. Sillä taas oli huomattavasti samantapaisia vaikutuksia kuin SCF-kompleksilla.

Myöhemmin havaittiin, että Vif sisälsi sytokiinisignaloinnin (SOCS) boxin kaltaisen motiivin (SLQ(Y/F)LA) konservoidun suppressorin, vaimentajan. Em motiivi taas kiinnittyy elongiiniC:hen, joka rekrytoi tekijät elongiiniB, culliini5 ja Rbx1. Tästä sitten muodostuu ElongiiniB/C-Cul5-SOCS-box( ECS) E-ubikitiiniligaasikompleksi Vif -vaikutuksesta.

Näitten interaktioitten seurauksena APOBEC- proteiinit polyubikitinyloituvat ja joutuvat hajoitetuiksi.

Samansuuntaisesti eräät tutkijaryhmät havaitsivat, että Vif triggeröi vain marginaalisesti hA3G hajoittamista, mikä viitaisi siihen, että Vif voi vetää erilleen hA3G kapsidikoteloon menevästä joukosta degradaatiosta riippumattomallakin mekanismilla.

6.1. SITAATTI. In contrast to HIV-1ΔVif, wild-type HIV-1 is not restricted in non-permissive cells. Thus, Vif counteracts the effects of hA3F and hA3G. Indeed, Vif binds and triggers the degradation of these APOBEC proteins in producer cells, thus blocking their incorporation into virions . Initially, Vif was demonstrated to interact with cellular proteins Cul5, elonginB, elonginC, and Rbx1 to form a cullin-based E3 ubiquitin ligase complex, which displays striking similarities to SCF complex. Later, Vif was found to contain a conserved suppressor of cytokine signaling (SOCS) box-like motif (SLQ(Y/F)LA) that binds elongin C, which in turn recruits elongin B, cullin 5 and Rbx1, thus forming the ElonginB/C-Cul5-SOCS-box (ECS) E3 ubiquitin ligase complex. As a consequence of these interactions, APOBEC proteins are polyubiquitylated and degraded. In parallel, some groups observed that Vif triggers only a marginal degradation of hA3G, which suggested that Vif could sequester hA3G from encapsidation through a degradation-independent mechanism.

6.2.Vif inhiboi hA3GN antiviraalia funktiota lajispesifisesti

Vaikka Vif blokeeraa hA3G:n antiviraalin aktiivisuuden, sen aktiivisuus on mitä suurimmassa määrin lajispesifistä. Vif, joka on peräisin ihmisen tai simpanssin HIV-1 viruksesta blokeeraan ihmisen ja simpanssin hA3G ja chA3G antiviraalin proteiinin, mutta ei vanhan maailman apinoitten vastaavaa proteiinia.

Vif joka on peräisin SIVmac blokeeraa kaikki A3G-isoformit niin ihmiseltä kuin nisäkäseläimiltä.

Vif joka on peräisin SIVagm blokeeraa A3G-proteiinit vain apinoilta.

hA3F voi inaktivoitua Vif-proteiineista HIV-1, HIV-2 ja SIVmac, mutta ei SIVagm.

hA3C voi inaktivoitua Vif -proteiinista, joka on SIVmac.

Mikään Vif proteiini ei voi inaktivoida hA3B, rotan A1 tai hiiren APOBEC3(mA3).

On ponnisteltu, että voitaisiin selvittää, mikä molekulaarinen mekanismi on takana lajispesifisissä eroissa ja tutkimuksiin valittiin agmA3G, koska se muistutti eniten ihmisen hA3G-proteiinia.

Vif, joka oli HIV-1 viruksesta, epäonnistui inaktivoimaan agmA3G:tä, koska se sisältää lysiiniä ennemminkin kuin aspartaattia asemasa 128(K128D), mikä on hA3G:ssä.

Vaikka agmA3G ei sido Vif-proteiinia eikä sijoita sitä virioniin, sellainen mutantti agmA3G, jossa on D128 aspartaatti, on täysin sensitiivinen HIV-1 viruksesta peräisin olevalle Vif-proteiinille.

Lisäksi tehty käänteinen muutos, jossa on vaihdettu D aspartaatti K lysiiniksi asemassa 128 hA3G-proteiinissa, muuttaa proteiinin resistentiksi Vif-vaikutukselle.

Kun on tehty rakenteellisia vertailuja E.Colin vastaaviin cytidiinideaminaaseihin,on havaittu että D128 kartoittuu alfahelix-kierteeseen ulkonevassa silmukassa. Koska samaa K128 lysiiniä esiintyy rhesus macaque(mac A3G) A3G-proteiinissa, sen sensitiivysyys saattaa myös olla muuttunut samanlaisesta K128D substituutiosta. Vaikka nämä tutkimukset osoittava todeksi keskinäistä korrelaatiota Vif proteiinin kyvyssä neutraloida APOBEC proteiineja ja virusreplikaatiossa, ei kuitenkaan pidetä todennäköisenä että Vif olisi vastuussa nisäkäslentiviruksen leviämisestä uusiin isäntälajeihin, vaikka APOBEC proteiinit ovtkin lajispesifisiä Vif-proteiinille.

6.2. SITAATTI Although Vif blocks the antiviral activity of hA3G, its activity is highly species-specific. Additionally Vif from HIV-1 blocks A3G proteins from humans and chimpanzees (hA3G and chA3G), but not from old world monkeys, Vif from SIV_mac blocks all A3G isoforms from human and non-human primates, and Vif from SIV_agm only blocks A3G proteins from monkeys. In addition, hA3F can be inactivated by Vif proteins from HIV-1, HIV-2, and SIV_mac, but not from SIV_agm . Moreover, the hA3C can be inactivated by Vif from SIV_mac .and no Vif protein can inactivate the hA3B, rat A1, or mouse APOBEC3 (mA3) proteins. Efforts have been made to uncover the molecular mechanisms of these species-specific differences, and agmA3G was chosen because it is most similar to hA3G. It was found that Vif from HIV-1 fails to inactivate agmA3G because it contains a lysine rather than aspartate at position 128 (K128D), which is found in hA3G. Although agmA3G neither binds Vif nor is excluded from virions, the mutant agmA3G protein bearing D128 becomes fully sensitive to Vif from HIV-1. In addition, the reciprocal exchange of D for K at position 128 in hA3G renders it resistant to Vif. Structural comparisons with the related cytidine deaminases from E.coli reveal that D128 maps to an α-helical turn on an exposed loop. Since the same K128 residue also exists in A3G from rhesus macaque (macA3G), its sensitivity might also be altered with a similar K128D substitution. Although these studies established the correlation between the ability of Vif to neutralize APOBEC proteins and viral replication, it is unlikely that these species-specific susceptibilities of APOBEC proteins to Vif are responsible for the transmission of primate lentiviruses to new host species.

7 Virukset ilman Vif-tekijää tai mobiileja geneettisiä elementtejä_

Viruses that lack Vif and mobile genetic elements

Miten virus kiertää intrasellulaarisen immuniteetin, jos se ei koodaa Vif proteiinia?

How can viruses that do not encode Vif escape from this intracellular immunity?

7.1. Virus tuottaa dUTPaasia ja välttää dUTP-inkorporaation

Koska eräät APOBEC proteiinit voivat inhiboida EIAV, HBV ja MLV replikaatioita, täytyy olla jokin lisä mekanismi, millä voi järjestelmää kiertääkin. Mitä tulee EIAV-virukseen se koodaa lisäentsyymiä, jonka nimi on dUTPaasi. Tätä virusta tuottaa myös herpesvirus, poxvirukset ja eräät muut retrovirukset. Äskettäin on osoitettu caprine arthritis encephalitis virukselta (CAEV) dUTPaasia, joka pystyi blokeeraamaan dUTP:n virheellisen inkorporoitumisen HIV-1 viruksen käänteiskopiointivaiheesen. Joten sen dUTPaasi pystyi suojaamaan myös EIAV-virusta APOBEC-proteiinien hyökkäykseltä. Mitä tulee HBV-virukseen, se lisääntyy kudoksissa, jotka eivät ilmennä hA3G proteiinia. MLV-viruksen suhteen tilanne on komplisoidumpi. Ihmisen solut ilmentävät seitsemää A3-proteiinia ja hiirellä on taas vain yksi A3-geeni. Vaikka mA3 blokeeraa HIV-1 ja SIV replikaation, se on heikompi teholtaan pakkautumaan eikä pysty estämään MLV-virusta. Joten MLV on adaptoitunut luonnolliseen isäntäänsä mekanismilla, joka jää heikommin ymmärretyksi.

7.1.SITAATTI. As some APOBEC proteins also inhibit the replication of EIAV, HBV, and MLV, there must be additional mechanisms of escape. In the case of EIAV, it encodes an additional enzyme, which is named dUTPase. This enzyme is also produced by herpesviruses, poxviruses, and some other retroviruses. Recently, it was demonstrated that dUTPase from caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) could block the misincorporation of dUTP during HIV-1 reverse transcription. Thus, its dUTPase could also protect EIAV from attack by APOBEC proteins. In the case of HBV, it replicates in tissues that do not express hA3G. The situation for MLV is more complicated. Unlike human cells that express seven A3 proteins, the mouse genome contains only one A3 gene. Although mA3 blocks the replication of HIV-1 and SIV, it is less efficiently packaged into and does not inhibit MLV. In contrast, hA3G blocks the replication of MLV. Thus, MLV has adapted to its natural host by a mechanism that remains poorly understood.

7.2. Retrotransposonit, retrovirusten kaltaiset liikkuvat geneettiset elementit

Mikä on tilanne retrovirusta muistuttavien mobiilien geneettisten elementtien suhteen? Ihmisessä ja hiiressä on useita eri tyyppejä retrotransposoneja. Kaikkein runsain on LINE-1 tai L1 elementit, jotka eivät sisällä LTR (Long Terminal Repeats). Noin sata ihmisen L1-elementtiä ja useita tuhansia hiiren L1 elementtejä on funktionaalisia. Vaikka ne vaativat käänteiskopiointia, ne eivät muodosta VLP eikä APOBEC proteiinit blokeeraa niiden replikaatiota.

Sitävastoin LTR-pitoiset retrotransposonit, jotka edustavat noin 10% ihmisen genomista, muodostavat VLP, silmukoituvat intrasellulaarisista organelleista ja käyttäytyvät samankaltaisesti kuin soluun tulevat exogeeniset retrovirukset.

Vaikkakaan ei ole löydetty yhtään aktiivia ihmisen endogeenia retrovirusta (HERVs), niin hiirellä on useita satoja aktiiveja intrakisternaalisia A-partikkeleita (IAPs) ja ainakin kymmenen kopiota MusD. Ja IAP sekä MusD sisältävät useita G-A muuttumisia genomissaan. Transient expression- menetelmällä on soluista havaittu että hA3G ja mA3 inhiboivat IAP ja MusD retrotranspositiota.

Täten APOBEC proteiinit voivat myös blokeerata joidenkin mobiilien geneettisten elementtien liikkumista todennäköisimmin itusoluissa ja embryogeneesin aikana nisäkkäillä.

7.2. SITAATTI. What is the situation with mobile genetic elements that resemble retroviruses? In humans and mice, there are several types of retrotransposons . The most abundant are LINE-1 or L1 elements that do not contain long terminal repeats (LTRs). Up to one hundred human and several thousand mouse L1 elements are functional. Although they require reverse transcription, they do not form VLPs and APOBEC proteins do not block their replication. In contrast, LTR-containing retrotransposons, which represent up to 10% of the human genome, form VLPs, bud from intracellular organelles and behave similarly to incoming exogenous retroviruses. Although no active human endogenous retroviruses (HERVs) have been found, in the mouse, there are several hundred active intracisternal A-particles (IAPs). and at least ten copies of MusD. Indeed, sequences of IAPs and MusDs contain frequent G to A transversions in their genomes. In addition, using transient expression assays in cells, hA3G and mA3 inhibit the retrotransposition of IAP and MusD. Thus, APOBEC proteins also block the movement of some mobile genetic elements, most likely in germ cells and during embryogenesis, in mammals.

8 Muita antiviraaleja geenejä solunsisäisessä immuniteetissa_Other antiviral genes that contribute to intracellular immunity

8.1. ZAP tehoaa erittäin hyvin ainakin alfaviruksiin

Em virusreplikatiota blokeeraavasti vaikuttavien tekijöiden ohella on muitakin lisäesteitä kuvattu transkription tasolta ja RNA-stabiliteetista ja myös uuden virionin kokoostamisvaiheesta. Niitten merkitys solunsisäisessä immuniteetissa on kuitenkin vähäisempää, koska ne eivät pysty blokeeraamaan proviruksien integroitumista isäntäsolun genomiin.

Ensinnäkin Murr1 blokeeraa NF-kB aktivaation lepovaiheesa olevassa solussa ja täten HIV-1 viruksen replikaation induktio blokerautuu.

Toiseksi eräässä geneettisessä seulonnassa, jossa tutkittiin *soluja, jotka jäivät eloon MuLV hyökkäyksen jälkeen ja joissa oli Tk-geeni( tymidiinkikinaasigeeni) paljasti löytönä ZAP-proteiinin. Zn++ Finger antiviraali proteiini (ZAP) hajoitti nopeasti MLV-transkriptejä.

( *Solut olisivat muuten menehtyneet trifluoro-T muotoon , jos ne eivät olisi fosforyloitunet Tk:lla)

ZAP sitoutuu spesifiseen sekvenssiin viruksen transkriptien 3´päähän, mutta ei solun transkripteihin, ja johtaa ne nopeaan hajoittamiseen exosomeissa.

Tämä mekanismi on ilmeisesti analoginen tristetraproliinille, joka sitoo AU-pitoisia RNA-lajeja ( esim. niitä jotka koodaavat sytokiinigeenejä) ja kohdentaa ne nopealle silppuroitumiselle sytoplasman exosomisssa.

Ei ainoastaan retroviruksen transkriptit ole ZAP-kohdistettuja, mutta se tuhoaa myös Ross Rivers, Semliki, Sindbis ja Venezuelan equine encephalitis (VEE) viruksia

Vaikka ZAP on äärimmäisen tehokas alfaviruksia vastaan ja MuLV vastaan, ei olla selvillä siitä, mikä sen osuus on vai onko sillä osuutta ollenkaan nisäkkäitten retroviruksia vastaan

SITAATTI 8.1. Besides these predominant blocks to viral replication in cells, additional barriers have been described at levels of transcription and RNA stability, as well as assembly of progeny virions. However, since they do not block the integration of proviruses into the host genome, they play lesser roles in intracellular immunity. First, Murr1 blocks the activation of NF-κB in resting cells and thus the induction of HIV-1 replication .

Second, a sophisticated genetic screen looking for cells that survive attack by MuLV bearing the thymidine kinase (tk) gene (which would otherwise succumb to trifluorothymidine that is phosphorylated by tk) revealed the Zn++-finger antiviral protein ZAP that degrades rapidly MLV transcripts.

ZAP binds a specific sequence at the 3' end of viral, but not cellular, transcripts and leads to their rapid degradation in the exosome.

This mechanism appears analogous to tristetraprolin, which binds AU-rich RNA species (e.g. those coding for cytokine genes) and targets them for rapid degradation in the cytoplasm. Apparently, not only are retroviral transcripts targeted by ZAP, but it destroys Ross River, Semliki, Sindbis and Venezualan equine encephalitis viruses, all of which belong to the alphavirus family .

Although ZAP is extremely efficient againt alphaviruses and MuLV, it is not clear what role, if any, it plays against primate retroviruses.

8.2. TASK-1 kaliumkanava ja Vpu

Viime vaiheen intrasellulaarinen immuniteetti kohdistuu uusien virusten kokoamisvaiheeseen (assembly, release of progeny virions).

HIV-1 on oppinut evolutionaalisesti koodaamaan tähänkin tarpeeseensa erästä virusproteiinia u (Vpu), mikä kiihdyttää uusien virionien vapautumista infektoituneesta solusta. Analogisesti Vif-tilanteen kanssa ovat toiset solut virusreplikaation suhteen Vpu:n puutteessa ”permissiivisiä” ja toiset ovat ”non-permissiivisiä”. Niitten väliset heterokaryonit ylläpitävät non-permissiivistä fenotyyppiä, mikä on dominantti. Joten Vpu:n on vastavaikutettava jollekin dominantille negatiiviselle solutekijälle, jonka identiteetti jää määriteltäväksi. Mielenkiintoista on, että viimeisten tutkimusten mukaan Vpu vastavaikuttaa kahden aukon (K2p) kaliumkanavaan TASK-1, mikä inhiboi monien virusten vapautumista tuntemattomalla mekanismilla, todennäköisesti muuttamalla kalvon fluiditeettia..Vpu kiihdyttää muidenkin retrovirusten vapautumista.

Vpu matkii TASK-1 proteiinin luonnollista komponenttia ja pääse inkorporoituman kanavaan, missä se toimii dominanttina negatiivisena vaikuttajana. Vpu myös sitoo βTRCP, joka on E3 ubikitiini-ligaasi ja joka voisi kiihdyttää TASK-1:n menoa proteosomisilppuriin. Joten on mahdollista, että TASK-1 pitoisuudet ja/ tai TASK-1 polymorfismi on lähinnä vastuussa blokista virionin kokoamisessa ja virioneitten ulospäästämisessä. Mutta tämän yhteyden ja viruksen replikaation viime vaiheen askeliin osallistuvien muitten lisätekijöitten osoittamiseen tarvitaan lisätutkimuksia.

SITAATTI 8.2. The final level of intracellular immunity deals with viral assembly and release. Again, HIV-1 encodes another accessory viral protein u (Vpu), which facilitates the release of progeny virions from infected cells. Thus, analogous to the situation with Vif, some cells are "permissive" and others are "non-permissive" for viral replication in the absence of Vpu. Heterokaryons between them maintain the non-permissive phenotype, which is dominant. Thus, Vpu must counteract some dominant negative cellular factor, whose identity remains to be determined. Of interest, recent work suggests that Vpu counteracts the two-pore K+ (K_2P) channel TASK-1, which inhibits the release of many viruses by an unknown mechanism, possibly by changing membrane fluidity. Vpu also facilitates the release of other retroviruses. By mimicking a natural component of TASK-1, Vpu is incorporated into the channel, where it acts as a dominant negative effector. Vpu also binds βTRCP, an E3 ubiquitin ligase, which could accelerate the degradation of TASK-1 in the proteasome . Thus, it is possible that levels and/or polymorphisms of TASK-1 are mostly responsible for this block in the assembly and release of progeny virions. However, additional experiments are required to make this connection and/or to reveal additional players in this last step of the viral replicative cycle in cells.

9 Solunsisäinen immuniteetti_ Intracellular immunity

9.1. Solun sisäisen antiviraalin immuniteetin laadusta

Solunsisäisestä taistelusta retroviraalia infektiota vastaan mainittakoon,

että tämä inhibitiovaikutus on laaja-alainen.

ENSINNÄKIN ei vain retrovirukset ole kohteena, vaan muutkin virukset, kuten HBV ja alfavirukset ja eräät liikkuvat geneettiset elementit retrotransposonit, jotka aiemmin ovat olleet itse viruksia.

TOISEKSI: Näitten virusten replikaatiossa on moni askel inhiboituna, ehkä siksi että mikään yksittäinen mekanismi ei ole riittävän tehokas. Nämä havainnot saattavat heijastaa pieniä eroja extrasellulaaristen patogeenien ja normaalien solujen homeostaattisten mekanismien välillä. Toisaalta sellainen saattaa heijastaa eri patogeenien laajaa spektriä, joille kaikille täytyy löytyä jotain kohdentajaa ja tuhoajaa. Retrovirus asettaa kasvavat haasteet, koska niillä on mutaatiotahti niin nopea ja ne sopeutuvat isäntäsoluun pikaisesti.

KOLMANNEKSI: Tällaiset intrasellulaarist blokit ovat huomattavampia ja tehokkampia zoonoottisissa infektioissa, joissa virus hyppää lajista toiseen.

LOPUKSI: Tämä inhibitio on nopeaa ja kohdistuu ensisijaisesti näitten virusten replikatiivisen syklin varhaisiin vaiheisiin. Tavoitteena on koettaa estää viruksen geneettisen materiaalin integroituminen isäntäsolun genomiin. Jos nämä inhibiittorit täyttävät tehtävänsä kohdentamalla (targeting) viruksen rakenteita tai geneettistä materiaalia kohti endosomeja tai exosomeja tai proteosomeja

( proteiinisilppuria), lopputulos on sama, viruksen eliminaatio. Näissä maisemissa tulokset riippuvat soluproteiinien tehokkuudesta ja toisaalta viruksen protektiivisesta varustautumisesta.

9.1. SITAATTI. Several themes emerge from these cell-intrinsic blocks to retroviral replication. First, the inhibition is broad. Thus, not only are retroviruses targeted, but other viruses as well, from HBV and alphaviruses to some mobile genetic elements, which once were viruses themselves. Second, multiple steps in the replicative cycles of these viruses are inhibited, most likely because each mechanism is not completely effective. This finding might reflect small differences between extracellular pathogens and normal cellular homeostatic mechanisms. Alternatively, it might reflect the vast spectrum of different pathogens, all of which must be targeted and destroyed. For retroviruses, the challenge is increased because of their rapid rate of mutations and their quick adaptation to the host. Third, these intracellular blocks are more pronounced and effective in zoonotic infections, where the virus jumps species. Finally, this inhibition is rapid and targets predominantly early steps in the replicative cycles of these viruses. Thus, it tries to prevent the integration of the viral genetic material into the host genome. Whether these inhibitors accomplish this task by targeting viral structures or genetic material to an endosome, exosome or proteasome, the end results are the same, i.e. the elimination of the virus. In this scenario, the outcome depends on the effectiveness of cellular proteins versus the protective armor of the virus.

9.2. Solun sisäisen antiviraalin immuniteetin hyödynnyksestä

Näihin havaintoihin perustuen voisi uutena terapeuttisena interentiona olla yksinkertaisesti näitten antiviraalien proteiinien intrasellulaarisen tason lisääminen: Näitä olisivat esim. TRIM5alfa, APOBEC proteiinit, ZAP ja /tai TASK-1. Nyt jos vain pystyttäisiin ymmärtämään niitten normaalia säätelyä, olisi mahdollista, että voitaisi lisätä niiden määrää ja aktiviteettia aktiivien infektioiden aikana. Mutta nyt ei tiedetä edes niiden muita funktioita solussa. Esim. saattaisiko kohonneet APOBEC3G pitoisuudet aiheuttaa genomisen DNA:n editoimista ( transkriptiota) replikaation aikana ja vaikuttaa täten onkogeenista transformaatiota

Kohdentaisiko lisääntyneet ZAP-määrät kriittisiäkin solutranskriptejä kiihtyneeseen degradaatioon?

Toisaalta voitaisiin koettaa blokeerata interaktio Vif ja APOBEC3G proteiinien välillä tai TASK-1 ja Vpu proteiinien välillä.

Mahdollisesti kun niitten rakenteita tutkitaan, voidaan hahmotella inhibiittori näihin proteiini-proteiini-interaktioihin.

Lisäksi kaikki nämä prosessit voidaan myös kohdentaa geeniterapialla, kun soluihin johdetaan niitten vastaava rakenne eri lajista ja/ tai vaihdetaan sitovat pinnat isäntäproteiinista, niin että ne esim. eivät enää tee interaktiota Vif tai Vpu proteiineihin. Jos tämä ei ole kliinisesti käytännöllistä, sellainen geneettinen manipulaatio voisi tuottaa tärkeitä viitteitä, kuten sellaisia, mihin restriktioon pitäisi kohdentaa muilla terapeuttisilla keinoilla.

9.2. SITAATTI Given these observations, one of the simplest new therapeutic interventions could be simply to increase intracellular levels of these antiviral proteins, e.g. TRIM5α, APOBEC proteins, ZAP and/or TASK-1. Thus, if we only understood their normal regulation, it is possible that we could augment their amounts and activities during active infections. Of course, as we do not know their other functions in cells, there are also many potential concerns. For example, would increased levels of APOBEC3G cause editing of genomic DNA during replication, thus facilitating oncogenic transformation? Likewise, would increased amounts of ZAP target critical cellular transcripts for accelerated degradation? Alternatively, one could try to block interactions between Vif and APOBEC proteins and TASK-1 and Vpu. Possibly, by studying their structures, one could design inhibitors for their protein-protein interactions. Moreover, all these processes can also be targeted by gene therapy, by introducing into cells their counterparts from different species and/or by changing binding surfaces of the host proteins so that they no longer interact with Vif or Vpu, for example. If not practical clinically, such genetic manipulation would yield important clues as to which restriction should be targeted by other therapeutic means.

10 Yhteenveto_ Conclusion

On merkittävä, miten hyvin ihmiskeho puolustautuu sisäisiltä ja ulkoisilta haasteilta. Ihmiselle on kehittynyt ainakin kolmen tason immuniteetia. INTRASELLULAARINEN ja LUONNOLLINEN IMMMUNITEETTI toimivat pääasiassa patogeenin mallin tunnistuksella (PAMP), kun taas ADAPTOITUVA immuniteetti on hyvin sekvenssi- ja peptidispesifinen. Siitä huolimatta moni patogeeni pääsee tunkeutumaan läpi ja integroitumaan isäntäsolun geneettiseen materiaaliin.

Täten joittenkin puolustusmekanismien on myös pidettävä silmällä näitten mobiilien geneettisten elementtien liikkeitä ja vaikutuksia. On ilmeistä, että on hienoinen raja sellaisten retrotransposonien hallinnan ja sallinnan välillä. Koska sellaiset liikkuvat geneettiset elementit vaikuttavat evoluutioon ja kaikkien lajien kuntoon, niitä on pidettävä kontrollissa, mutta ei täysin eliminoitava ja on mahdollista, että tämä pulmallinen hAG3 aktiivisuuden säätely soluissa heijastaa näitä tarpeita.

Toisaalta virheitä tulee, kehityksellisiä defektejä tai syöpää ilmenee. Siitä huolimatta näitä extrasellulaarisia patogeeneja vastaan taistelevien järjestelmien tutkimisessa saataneen fundamentaalisia oivalluksia siitä soluprosessien paljoudesta, mikä pitää yllä ihmisen terveyttä tai aiheuttaa sairautta.

10.1. SITAATTI. It is remarkable how active are the processes that protect an organism from internal and external challenges. In humans, at least three layers of immunity have developed. Among them, intracellular and innate immune responses act primarily via pattern recognition, whereas adaptive immunity is very sequence and peptide-specific. Nevertheless, many pathogens break through and are integrated into the host genetic material. Thus, some of these defense mechanism must also survey the movements and effects of these mobile genetic elements. It appears that a fine line has been drawn between control and allowing for some escape as well. As mobile genetic elements contribute to evolution and fitness of all species, they must be kept in check, but not eliminated completely and it is possible that this intricate regulation of hA3G activity in cells reflects this requirement. On the other hand, there is also a high price to pay in terms of mistakes, be they developmental defects or cancer. Nevertheless, the study of these systems that fight extracellular pathogens is likely to reveal fundamental insights into a plethora of cellular processes that contribute to human health and disease.