(4) Miten APOBEC3 järjestelmä toimii ? Miten HIV Vif sitä haittaa?

Ensinnäkin miten APOBEC3 proteiinit  toimivat HIV restriktiossa ?


(I) Eric W. Refsland et Reuben S. Hrris.  The APOBEC3   Family of Retroelement Restriction Factors. In: Intrinsic immunity  Toimittaja  on Bryan R. Culten ( 2013).
Current  Topics in Microbiology and Immunology.
 ISBN 978- 3- 642- 37764-8.


Patogeenit kuten HIV joutuvat käsittelemään monenlaisia isäntäsolutekijöitä  ensinnäkin  hyödyntääkseen omaan replekoitumiseensa  niitä  ja toiseksi välttääkseen oman tuhonsa.. On havaittu että  10% ihmisen proteiineista  joko suoraan tai epäsuoraan vaikuttuu  HIV replikaatiosta Suurin osa näistä proteiineista  on viruksen hyödyntämia replikaatiota varten . Toisaalta pieni joukko näitä soluproteiineja  vaimentaa  suoraan viruksen replikoitumista. Ne proteiinit ovat restriktiofaktoreita.
Mikä on restriktiotekijän  tunnusmerkki?
Niillä on kykyä
estää  tehokkaasti viruksen replikaatiota,
merkkejä nopeasta  evoluutiosta  (positiivisesta valinnasta)
vastaavuutta  interferonille
apystyy neutraloimaan ainakin  viruksen  yhden restriktionvastaisen strategian.

Tässä  käsitellään ensin restriktiotekijää APOBEC3,
 Myöhemmin vielä kirjoitan uusinta tietoa muistakin restriktiotekijöistä kuten
 TRIM5alfasta, (Tripartite motif containing proteins)
Tetherin/BST-2:sta (Tetherin  or protein CD 317 or Bone marrow Stromal cell antigen 2 )
ja SAMHD1sta. ( The Sterile Alpha Motif and HD domain containing protein)

APOBEC3G

APOBEC3G on tutkittu hyvin paljon , yli 500  artikkelia siitä on olemassa ja nykykäsityksen mukaan  sen restriktion periaate   infektoituneessa T-solussa on  Troijan hevosen mallilla
 Trojan horse -like model for HIV restriction. Tästä on netissä kuvia.

1. Jotta APOBEC3G olisi tehokas HIV restriktion aiheuttajana, sitä tulee esiintyä infektoituneen, virusta tuottavan solun sytoplasmassa. 
2. Sytoplasminen APOBEC3G tehnee interaktion Gag RNP- kompleksin   ( Gag ribonukleoproteiinikompleksin  ) kanssa. Tämä interaktio on  välttämätön, jotta APOBEC3G pääsee pakkautumaan virioniin mukaan.  Tämä interaktio voi särkyä entsyymillä RNaasi, ribonukleaasi ja senvuoksi ajatellaan,  että siltana  APOBEC3G:n ja  Gag-nukleokapsidialueen kesken on RNA:ta. Siltamateriaalia  tutkitaan vielä. 
3. Kehnosti määritetyllä mekanismilla pakatun  APOBEC3G:n  on päästävä nukleokapsidin sisään,viruspartikkelin ydinkoteloon. Tämä  vaihe on geneettisesti määritelty,  mutta ei mekanistisesti, koska erilaiset kimeeriset rakenteet  voivat tulla pakatuksi viruspartikkeliin, mutta ne eivät mene sisälle ydinkoteloon  eivätkä aiheuta restriktiota.
4.  Kun  APOBEC3G:llä latautunut viruksen ydinkapseli asettuu kohdesoluun , alkaa  käänteiskopiointi,  (reverse transcription). virusRNA:sta,  joka on esim --GG--GA--
5. Ensin  syntyy yksisäikeinen (ss)  cDNA välituote.  (CC-CT)
6. Koska nyt esiintyy  singleDNA muotoa, APOBEC3G  voi  vaikuttaa siihen ja urasiloi sen.  Siis se deaminoi. sytosiinin C uridiiniksi U tietyssä dinukleotidissä. (-UC--UT) .
7. Urasiloitunut DNAsäie  voi nyt valita kaksi tietä. Se joko joutuu degradaatioon TAI se toimii templaattina sekundäärisäikeen synteesissä.  (-AG-AA).  Tämä synteesi edeltää integraatiota kohdesolun genomiin.  Siis urasiilit  koodaavassa DNA säikeessä  ovat kohtia (template) adeniineille (A) tuoreessa (+)säikeessä  ja tällä tavalla immortalisoituu   mutaatio   G :stä -- A:ksi ,  mikä puolstaan  jatkokierroissa  rajoittaa virusreplikaatiota.  Jos näitä mutaatioita on paljon, esiintyy hypermutaatiota.

Kaikki APOBEC3G kyvyt vaikuttqa restriktiota eivät liene deaminaasiominaisuudesta riippuvia.  On havaittu että  APOBEC3G  pystyy sitomaan virusperäistä genomista RNA:ta ja steerisesti  estämään RT käänteiskopioitsijan  etenemistä.

MUUT ABOBEC3-PROTEIINIT

Kun oli havaittu näitä APOBEC3G funktioita, alkoivat  tiedemiehet kiinnostua muista  perheenjäsenistäkin  joita oli vielä kuusi.

• HIV-1 infektoituneilta  eristettyjen provirusten  sekvenssejä tutkittaessa  saatiin selville kaksi erilaista   G:stä A:ksi mutatoitumismallia., joissa APOBEC3G oli välittänyt  deaminaatiota. 

5´´GG -AG;ksi mutaatio ja  5´GA-AA:ksi mutaatio 
Oli aiemmin osoitettu että  APOBEC3G omaa preferenssin  viruksen  (-) säikeen  5´ CC- dinukleotidiin,  (UC)sen  mikä johtaa  viruksen  5´GG :stä AG- mutaatioon. Se on tyypillisesti APOBEC3G:n aiheuttama.
Mutta koska on havaittu korkea pitoisuus proviraalista  5´ GA.sta AA:ksi mutaatiota,  on arveltu että  ainakin yhden  muunkin  APOBEC3 perheenjäsenen täytyy osallistua  tähän mutatoivaan restriktioon. Kuitenkin sitä on vaikea identifioida koska kaikki ne kuusi  muuta APOBEC3- proteiinia  suosivat  5´-TC dinukleotidin deaminaatiota.

• Soluun perustuvista tutkimusmalleista,  joissa on vahvistettu cDNA:n ilmeneminen, on raportoitu kaikkien seitsemän APOBEC3proteiinin  aktiviteettia.

Primäärisissä CD4+ T-soluissa, jotka ovat HIV viruksen pääkohde kehossa,  ilmenee kuutta APOBEC3 proteiinia havaittavissa pitoisuuksissa, mutta  APOBEC3A mRNA:ta  ei ole havaittavissa.
Vain neljä  APOBEC3 proteiinia pakkautuu viruksenkaltaisiin partikkeleihin  (APOBEC  3D, - 3F , -3G, 3H) ja ne estävät virusreplikaatiota jos niitä ilmenee   stabiilisti T-solulinjoissa .( Ne jotka eivät pakkaudu ovat - 3A, - 3B ja -3C) .

Lopuksi mainittakoon, että solutukiimuksissa on havaittu endogeenien  rpoteiinien  ABOBEC3D ja ABOBEC3F  kombinoituvan , mikä selittää non-permissiivisten T-solulinjojen 5´´GA:sta  AA:ksi mutaatioita.

Kaikissa solulinjoissa ei ole havaittavia  pitoisuuksia APOBECH mRNA:takaan eikä sen endogeenista osuuta voi arvioida. Sitä on lisäksi seitsemän varianttia ja vain yksi alaryhmä näistä haplotyypeistä on  protiinina stabiili ja kykenee HIV restriktioon.

 Ihmisväestössä on siis  luonnollista variaatiota. minkä  relevanssia   HIV restriktion suhteen  tutkitaan edelleen.

Yhteenvetona: 
Vaikka  kaikkia APOBEC3 proteiineja voi pakottaa deaminoimaan  virusperäsitä yksinkertaista  ( ss) DNA-säiettä  koeputkessa tai heterologisissa solulinjoissa  yliexpressiolla, niin vain neljä APOBEC3 proteiinia kykenevät toimimaan T-imusoluissa  HIV viruksen restriktiofaktoreina ja nämä ovat   APOBEC3D,  POBEC3F, APOBEC3G ja APOBEC3H.

KAIKKI MENESTYKSELLISET VIRUKSET  ovat kehittäneet sofistisia menetelmiä  ihmisen immuunivasteen vaimentamiseksi ( immunesupression)  ja/ tai   puolustuksen kiertämiseksi ( evasion) .
 ESIMERKKINÄ  kaikkein  tutkituimmista APOBEC3-restriktiotekijöitä vastustavista mekanismista  on HIV viruksen Vif- tekijä  Se on pieni baasinen proteiini,  23 kDa ja  virus tarvitsee sitä  elimistössä aiheuttamaan patogenisyyteensä ja samoin  myös  monosyyteissä, makrofageissa, primääreissä  CD4+ T-soluissa ja non-permissiivisissä T-soluissa  replikoitumiseen koe-olosuhteissa.
Vif rekrytoi  HIV:n infektoimasta solusta  multiproteiini E3 ubikitiiniligaasikompleksin, joka käsittää CUL5/NEDD8, ELOB, ELOC, RBX2 ja CBFbeta , mitkä välittävät APOBEC3-restriktiotekijän tuhoamisen proteosomisilppurissa, siis solun omassa  roskakorissa.
 Tämän lisäksi Vif voi vapauttaa virusta APOBEC3G-välitteisestä restriktiosta alternatiivisestikin, sakkaamalla proteiinin katalyyttisesti inaktiiviin konformaatioon tai se voi estää APOBEC3G translaatiota.
 Mutta näistä Vif- vaikutuksista  haittaavin on  proteosomisilppuri.