Lukemattomat interaktiot HIV- viruksen ja isäntäsoluproteiinien kesken ( Springer)

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9
Paul Spearmanin kirjassa mainitaan sivulla 103 että HIV-1 virus elinsyklissään luottaa strategiassaan myriadeihin interaktioihin isäntäsoluproteiinien kanssa. Tämä tilanne asettaa valtavan haasteen tieteen tekniikalle. 

 Kappaleen otsikkona on
 Imaging of HIV/Host Protein Interaction, kirjoittajina C M Danielson et T J Hope

• Traditionaaliset biokemialliset lähestymistavat proteiini-proteiini-interaktioiden luotaamiseksi ovat kapasiteetiltaan rajoitettuja tutkimaan intaktin solun tilavuudellisia ja dynaamisia vuorovaikutuksia.

• Mutta fluoresoivin kuvausmenetelmin voidaan kuitenkin tutkia viruksen ja isäntäsolun proteiinien välisiä paikallistumisia ja dynaamisia interaktioita. Monta uutta fluoresointiin perustuvaa kuvaustekniikkaa on kehitelty viime vuosikymmenen aikana ja ne ovat olleet hyödyksi kuvattaessa HIV-1 virusproteiinien vuorovaikutusta isäntäsoluun.

• Tekniikat mitä tässä kirjassa otetaan esiin:( engl)Colocalization versus interaction; Probing association by energy transfer; Improving imaging condition by increasing sensitivity and resolution

• ESIMERKKEJÄ asioista mihin näillä uusilla menetelmillä on kohdistuttu ja mitkä tässä kappaleessa otetaan esiin. A. Viruksen sisäänmeno ( entry), B. Viruksen ulostulo ( exit) C. Säätely ja lisäproteiinit ( regulatory and accessory proteins)

JOHDANTO  mainitsee seuraavia seikkoja: Retrovirus HIV koodaa itselleen vain 15 proteiinia, mutta on kehittänyt huippuunsa isäntäsolun monien funktioiden anastamiskeinot. Niillä se hankkii itselleen sopivan miljöön elinsyklinsä täydellistämiseksi. Sillä on olemassa myriadit interaktiot, jotka suuntaavat uudelleen ja orjuuttavat isäntäsolun funktiota päämääränä onnistunut infektoiminen- ja isäntäsolun uupumus ja tuhoutuminen.Kun koetetaan selvitellä erilaisia molekulaarisia kohteita, joita voisi terapeuttisesti manipuloida, on tiedettävä viruksen komponenttien lisäksi myös löydetyt proteiini-interaktiot ovat merkityksellisiä vain, jos ne tapahtuvat in vivo. Jos sytoplasmassa ollut proteiini voisi rakenteellisesti tehdäkin interaktion tumaproteiinin kanssa, tällainen teoreettinen interaktio eri soluaitioista peräisin olevien proteiinien kesken on fysiologisesti irrelevanttia.
Biokemialliset tutkimukset voivat kyllä luonnehtia koeputkessa ( in vitro) joukoittain interaktioita, mutta uudet kuvaustekniikat visualisoivat interaktioita luonnollisina ja elävässä solussa.

ELÄVÄN SOLUN KUVANAMISTEKNIIKAT ovat minimaalisen invasiivisia lähestymistapoja kuvaamassa tarkemmin interaktioitten dynamiikka. Biokemiallisissa menetelmissä löydetyt proteiini-interaktiot ovat merkityksellisiä vain, jos ne tapahtuvat in vivo ( elävässä kehossa) . Jos sytoplasmassa ollut proteiini voisi rakenteellisesti tehdäkin interaktion tumaproteiinin kanssa, tällainen teoreettinen interaktio eri soluaitioista peräisin olevien proteiinien kesken on fysiologisesti irrelevanttia. Biokemialliset tutkimukset voivat kyllä luonnehtia koeputkessa ( in vitro) joukoittain interaktioita, mutta uudet kuvaustekniikat visualisoivat interaktioita luonnollisina ja elävässä solussa.
Kymmenen viime vuotta on lisännyt runsaasti tietoa ja tekniikkaa. Kirjaansa on Paul Spearman ottanut näistä tekniikoista kolme (yllämainittua) tarkemmin kuvattavaksi.
Sanoja mitä tekniikkaa kuvaavissa kappaleissa vilahtelee on mm
fluorescent microscopy, high resolution fluorescent imaging, laser scanning confocal microscopy, deconvolution microscopy, computer- based image restoration, digital cameras, spinning disc , fluorescence resonance energy transfer (FRET), bimolecular fluorescent complementation (BiFC), stimulated emission depletion (STED), photo-activated localization microscopy (PALM), total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy , traditional epifluorescence microscopy , evanescent field,
jne jne

• A. Mitä löytöjä on tehty viruksen soluunmenovaiheesta?
  

HIV-1 viruksen entry, sisäänmeno soluun. HIV menee CD4+Tyypin imusoluun sisälle sen jälkeen, kun virusvaipan (Envelope) glykoproteiini gp120 on sitoutunut CD4-reseptoriin, mikä sallii gp120 proteiinin tehdä interaktion ko-reseptoriin, joka on joko CCR5 tai CXCR4. Tällöin tapahtuu konformaation, struktuurin muutos.
http://2009.igem.org/wiki/images/d/d1/HIV_absorb_cd4_and_ccr5.png
Tämä struktuurinmuutos tuo esiin hydrofobisen fuusiopeptidin.  Fuusio viruksen vaipan ja ihmissolun plasmakalvon kesken tapahtuu. Fuusiossa pääsee viruksen sisällä oleva ydinkapsidi isäntäsolun sytoplasman elinnesteitten alueelle.
http://img.medscape.com/fullsize/migrated/editorial/conferences/2001/325/retro.04.gif
Kapsidin seinämäosat purkautuvat ns vaipasta vapautumistapahtumassa, uncoating -prosessissa ja sisällä oleva viruksen genominen aines, joka on kaksi (+)plus sense RNA-säiettä alkaa muuttua käänteiskopioivalla entsyymillä (RT) reversillä transkriptaasilla (RT),  DNA- kielelle ja viruksesta hahmottuukin nyt ds double strand DNA ja sitä kuljettava kompleksi PIC. (Sytoplasma ei siedä paljasta DNA:ta)

http://www.scielosp.org/img/revistas/aiss/v46n1/02f03.gif
http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/images/nrm1000_040a_f1.gif
VirusRNA mallista valmistettu rusi tuore dsDNA pakkautuu ja kapaloituu PIC- hahmoiseksi preintegraatiokompleksiksi, joka vie vastasyntyneen DNA:n ja useita viruksen tuomia proteiineja sekä solun proteiineja tumaan ja sitten tapahtuu alkuperäisin viraalin koodin DNA-kielisen hahmon integroituminen ihmisen kromosomistoon DNA:n joukkoon.
http://cochin.inserm.fr/research/scientific-departments/biocihp/team-berlioz-emiliani/nuclear-steps-of-hiv-1-replication/nuclear-steps-of-hiv-1-replication/images/Fig-1.jpg
Jos virus saa tehtyä tämän DNA-proviruksensa , se antaa ikuiset merkit ihmisen genomiin. Tässä vaiheessa infektiontekojärjestelmä voi sitten "hengähtää" ja olla latenttinakin, piilevänä.

Entry-prosessi luottaa hyvin lukuisiin interaktioihin isäntäsolun eri proteiinien kanssa, mistä (häikäilemättömästä ryöstöpolitiikasta) virus hankkii itselleen sekä  ( tässä ja nyt-)  hyödyn saada olla solun sytoplasmassa tuhoutumatta sekä pääsyn ihmisen tumaan DNA:n alueelle ( varmistaen lajitulevaisuuden) .

Näitten interaktioitten lokalisoitumisesta voidaan nykyisin helpommin saada tietoa fluoresoivilla menetelmillä.

• Mobiilit reseptorit entry-vaiheessa

Normaalisti HIV-sisäänmenon reseptorit sijaitsevat tiheämpinä tietyissä domaaneissa 10 nm toisistaan. Viruksen Envelope-vaippapinnan gp120 indusoi interaktion reseptorien väliin.
FRET menetelmällä 2006 arvioitiin gp120 interaktio CD4 ja CCR5 reseptorien välillä. Normaalisti nämä reseptorit muodostavat omat erilliset mikrodomaanit, mutta jos on gp120 tulossa, ne tekevät kompleksin gp120:n kanssa viruksen sisäänmenovaiheessa. Gp120 saattaa CD4 ja CCR5 reseptorit yhteen elävän solun plasmamembraanissa Nämä reseptorit lokalisoituvat viruksen sisäänmenolle tärkeisiin lipidilevykohtiin ja jos nämä lipidilevyt kemiallisesti rikottiin, blokeerautui viruksen gp120-indusoima signaali, mutta kolesterolin palauttaminen lipidilevyyn ennallisti sen.

• Fluoresoivalla merkitsijällä merkattuja viruksia on tutkittu.

Ensimmäiset elävällä solulla tehdyt tutkimukset suoritettiin 2002, jolloin HIV viruksen lisäproteiini Vpr oli merkattuna.Voitiin havaita, miten HIV menee soluihin ja kaappaa solun mikrotubulaarisen verkoston käyttöönsä voidakseen suorittaa matkan kohti solun tumaa. Virus oli tässä vaiheessa täysin riippuvainen solun sytoskeletonrakenteesta saavuttaakseen virusgenomin lopullisen päämäärän, ihmissolun tuman.
FRT menetelmällä on kuitenkin rajoituksensa. Esim. Vpr ilmeisesti katoaa kuvioista ennen kuin virusmateriaali on selviytynyt tumaan asti, joten osasta HIV elämänsykliä  ei voida kuvantaa tällä merkitsijällä.

• Viruksen sisäänmenon (Entry) fuusiotapahtuman erottaminen endosytoosista

Eräs parannus virionin merkkaukseen on ollut Src:n 15 N-terminaalisen seriinin S15 merkkaus. Tämä virukseen inkorporoitunut sígnaali katoaa fuusion jälkeen, mutta ei nonproduktiivisen reseptorista riippumattoman endosytoosin jälkeen. S15 kohdistaa plasmamembraaniin ja tämä sekvenssi inkorporoituu virioneihin. Kaksoismerkinnällä S15 ja GFP-Vpr saadaan selkeä kuva virionista, joka on tullut soluun fuusiolla ja on produktiivinen: viruksen sisäntulotapahtuma on produktiivinen. Tällä erotetaan nonproduktiiviset, epärelevantit virionit.
Kaksoismerkintää voidaan käyttää tutkittaessa retroviruksen restriktiotekijää rhTRIM5alfa, joka käy interaktioon sytoplasmisen HIV-kompleksin kanssa. TRIM5alfakompleksiin assosioituivat ne virionit, jotka olivat menettäneet S15-merkitsijäaineen ja tulleet isäntäsolun sytoplasmaan fuusiolla.

• Miten virus matkaa tumakeskukseen? IN- merkkaus , DNA

GFP-Vpr merkitsemisen rajoituksena on, että sillä voidaan kuvata vain varhaisia postentry-tapahtumia, eikä ollenkaan tumassa liikkumisia tai intrasellulaarisia HIV-kompleksin interaktioita.
Mutta yksi askel eteenpäin on ollut integraasientsyymin (IN) merkkaus. Vuonna 2006 se voitiin merkata (F1AsH-tagged integrase, fluorescein arsenical hairpin) ja näin saatiin visualisoitua tumansisäisiä liikkeitä.
Saatiin havaituksi HIV integraasin liikekinetiikasta kohti tumaa sen käyttävän mikrotubuluksista ja aktiinista riippuvaa liikkumista. HIV-kompleksit lokalisoituivat siinä systeemissä tumaan rajoitetulla diffuusilla liikkeellä.
Vuonna 2008 F1AsH-menetelmää oli parannettu käyttämällä fluorophore-tagged integrase in trans Koska paikalleenpistetyt sekvenssit provirussekvenssien sisällä usein aiheuttavat prosessointiongelmia, tutkijat hyödynsivät sitä faktaa, että Vpr on inkorporoituneena virioneihin ja liittivät Vpr-tekijän fluoresoivasti merkattuun integraasiin. Tämä tehtiin siten, että HIV-proteaasin ollessa läsnä pilkkoutuma tapahtui niin, että Vpr erosi IN-EGFP:sta, merkatusta integraasista. Täten Vpr-IN-EGFP ilmeni in trans proviruskonstruktion kanssa sisältäen IN- deleetion sallien virionin produktion fluoresoivalla merkatulla integraasilla.

Albanese, jonka menetelmä tämä oli, tutki pikemminkin HIV viruksen suhdetta isäntäsolun DNA:han eikä niinkään isäntäsolun proteiineihin. Kun tutkittiin integroitumisen kohtia, paljastui HIV viruksen taipumus ensisijaisesti integroitua aktiivisti transkriboituviin geeneihin. Avoimen kysymyksenä on, mikä määrää tämän integroitumiskohdan suosituimmuuden. He havaitsivat myös, että virionit eivät tapaa vaellella pitkälle tumaan saapumisen jälkeen ja suosituimmuudet on etsittävä purkautuneitten (dekondensoituneitten) kromatiinien alueelta. Tämä on vasta löytöjen alkua siitä, mihin genomikohtiin HIV assosioituu, mutta avaa monia näkymiä jatkotutkimuksiin tumansisäisistä interaktioista.

• B. Entä miten virion lähtee solusta ulos (Exit)

Kun virus on integroinut sen käänteiskirjoitetun genominsa DNA:n isäntäsolun genomiin, muodostunut provirus toimii templaattina,  josta sitten voi tavalliseen tapaan transkriboitua RNA:ta
Nyt alkaa sitten viruksen proteiinien syntetisoiminen ( HUOM: aivan kuin solun omatkin proteiinit. Ensin lähettiRNA, mRNA, joka menee sytoplasmaan ja etsii sopivat tRNA:t ja ribosomeilla translatoituu peptidiketjuiksi ja proteiineiksi. Näitä proteiineja sitten kokoontuu (Assembly) viruksen säätämässä sekvenssissä solun plasmakalvon lähelle ja silmukoituu epäkypsinä virioneina infektoidusta solusta ulos. Tässä on avuliaasti apuna isäntäsolultta kaapatut järjestelmät: endosomaalisen lajittelun kompleksi, jota virus tarvitsee tuotteen kuljetuskoneistossa (ESCRT) kulkeutumiseen. Epäkypsät virionit suorittavat kypsymisen ja sitten ovat valmiina infektoimaan muita kohdesoluja. Kuvantamistekniikat ovat antaneet paljon tärkeää uutta tietoa uusien virioneitten koostamisen interaktioista ja dynamiikasta.

Korreloiva kuvantamistekniikka ( Correlative Imaging). Fluoresoivalla merkkiaineella merkatut viriot sopivat soluun menoa (entry) koskevien seikkojen tutkimuksen, mutta muita metodeita on käytettävä kuvaamaan nuppuilevan (budding) virionin ulosmenoa (egres).Tässä on kombinoitava tekniikkoja. Verrataan high-resolution electron microscopy tekniikkaa ja fluoresoivaa kuvantamistekniikka visualisoitaessa molekyylejä solun sisätilassa. Tällä voi visualisoida retrovirusvirionin nuppuilun
Lisäksi voidaan hyödyntää transfektoidun Gag -polyproteiinin multifotoni laser scanning mikroskopiaa (MPM) ja jatkossa scannin electron microscopy-tekniikkaa (SEM). SEM voi nähdä yksittäiset nuppuilut, mutta on käytettävissä vain pinnan kuvaukseen. Fluoresoiva tekniikka voi kuvantaa vain solun sisällä olevaa ja virionin silmukoitumisen voi vain päätellä fluoresenssin katoamisesta.
On tutkittu myös yksittäisten partikkelien menemistä solun sisään
Larson et al. on visualisoinut elävissä soluissa mm. yksittäisen HIV-1 viruksen nuppuilun, virus like particles (VLP) ym. ja vertaillut fluoresoivissa tekniikoissa saatuja tuloksia SEM tuloksiin.

• ESCRT eskortti mikrodomaanien kautta.Tetraspaniini

Aiemmin fluoresenssimikroskopialla oli havaittu HIV- partikkelin tekevän interaktion tetraspaniinin CD63 ja HIV Gag - polyproteiinin välille. Asian funktionaalista merkitystä ei kuitenkaan voitu käsittää. Tavallisessa yksinkertaisessa värjäyksessä vain pieni osa CD63:sta sijaitsee plasmakalvossa ja suurin osa sijaitsee intrasellulaarisissa kalvoissa (2003)  Seuraava askel tämän interaktion tutkimuksessa oli vuodelta 2006. Interaktion jatkotutkimuksissa selektiivisesti värjätty pinta-CD63 esiintyi ryväksittäin mikrodomaaneissa eikä tasaisesti jakaantuneena kautta plasmakalvon.
Korkean resoluution immunoelektromikroskopialla kombinoituna fluoresoivaan kuvantamiseen voitiin nähdä elävässä solussa tetraspaniinin rikastamat mikrodomaanit (TEM) .
TEM mikrodomaanit muodostuivat lähellä clathriinilla katettuja alueita ja sytoskeletaalisia elementtejä.
Osoittautui, että ESCRT1 komponentit Tsg101 ja Vps28 (joita vaaditaan virionin nuppuiluun), rekrytoidaan TEM:eille, joka sijaitsee samassa kuin Gag ( colocalization)

• Koneiston jaettu käyttö

Vaikka on hyvin, hyvin paljon tutkittu HIV-1 virioneitten ulospurkaantumista solusta, on asiassa varmaan jotakin löydettävää myös fluoresenssi mikroskooppitutkimuksissa.
Traditionaalisissa co-lokalisaatiotutkimuksissa havaittiin solukoneiston jaettua käyttöä viruksen ulospurkautumisen ja solun sytokineesin kesken. Vuonna 2007 hiivassa havaittiin ESCRT - koneiston ja sytokineesikoneiston komponenttien interaktioita ja fluoresenssimikroskopialla tutkittiin näitten oletettujen interaktioiten paikallistumisia.
http://www.nature.com/nrmicro/journal/v5/n12/fig_tab/nrmicro1790_F2.html
ESCRT proteiinit Tsg101 ja Alix sitovat sentrosomaalista proteiinia Cep55,. joka osallistuu sytokineesiin. Kun Cep55 expressio katkistaan siRNA:lla eivät Tsg101 eikä Alix enää sijaitse tavallisilla paikoillaan. Tutkijat kartoittivat Tsg101 aminohapot vastaamaan sitoutumisesta Cep55 proteiiniin ja havaitsivat deleetiolla tapahtuvan saman poikkeavan lokalisoitumisen. Kun he havaitsivat tämän silmänpistävän esimerkin viruksen tavasta anastaa niinkin tärkeä solun basaalifunktioitten kuin solunjakautumisen koneisto , he löysivät Tsg101-Cep55 interaktion olevan välttämätön sytokineesille, mutta ei viruksen ulosnuppuilulle.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17853893
Tutkimalla eri komponenttien vaatimuksia rekvisiittoina toimivissa solufunktioissa jotka virus on valjastanut replikaatioonsa, saattaisi olla mahdollista erotella spesifisiä interaktioita, jotka voitaisiin antivirusterapialla keskeyttää säilyttämällä samalla tarvittavat solutoiminnot.

• Virusten kaltaisten kappaleitten ulospurkaantumisen dynamiikkaa.

TIRF (Total internal reflection fluorescence ) on myös metodi virionmateriaalin kokoontumisen ja ulospääsyn kuvantamisessa. Vuonna 2008 tehtiin TIRF kuvantamisen kombinointi FRET:n kanssa ja f(uoresecnce recovery after photobleaching) FRAP- objektiivisempina metodeina interaktioitten määrittämiseksi viruksen purkaantumistutkimuksissa.
TIRF salli tutkijoitten kuvantaa Gag VLP purkaantumista reaaliajassa, mikä on vaikea tehtävä epifluoresenssissa, koska sytoplasmisen Gag-peräisen signaalin vahvuus voittaa heikon purkautumassa olevan VLP partikkelin signaalin. TIRF kuvantaa noin 100 nm alueelta.
Kinetiikkaa tutkittaessa havaittiin kahta sorttia Gag-populaatiota. Oli hitaasti ilmaantuvaa ja nopeasti ilmaantuvaa katoavaa. Käytettiin endosomaalisena merkitsijänä CD63. Nopeasti ilmenevä ja katoava Gag värjäytyi positiivisesti sekä CD63:lle että clathriinille, joten tämä populaatio liittyi endosomeihin. Niinpä he fokusoituivat hitaasti ilmenevään populaatioon, jota oli plasmakalvossa eniten edustettuna. TIRF teki mahdolliseksi karakterisoida näitä kineettisesti erilaisia Gag-populaatioita.
Sitten he käyttivät FRET metodia tulkkaamaan hitaasti pintaan nousevia partikkeleita Gag- molekyyleinä, jotka lähenevät toisiaan ja täten ovat käymässä läpi kokoontumistaan viruksen kaltaisiksi partikkeleiksi VLP.
Samantapaista FRET- metodiin perustuvaa menetelmää on hyödynnetty Gag-polyproteiinin oligomerisaatiotutkimuksissa. sekä elävässä solussa että viruksen kaltaisissa partikkeleissa (2004).
Vaikka Juvenetin tutkimus (TIRF, 2008) kohdistui primääristi virionin purkaantumisen dynamiikkaan, sitä voisi kokeilla lupaavana lähestysmistapana luonnehdittaessa prosessin aikaisia interaktioita, kuten soluproteiinien inkorporoitumista ja viraalin RNA:n inkorporoitumista purkaantuvaan virioniin.

• Superresolution budding- nanometrien tarkkuutta

Betzig et al ( 2006) raportoivat PALM menetelmän käytöstä (photoactivated localization microscopy). Tässä pystytään teoreettisesti erottamaan molekyylejä muutaman nanometrin tarkkuudella. Se ei lisää optista resoluutiota, mutta sallii fluoresoivien signaalien etäisyyksien alajaksojen mittauksen. Sekventiaalisella fotoaktivaatiolla ja subsekventiaalisella photobleaching menetelmällä voidaan määritellä lukuisten molekyylien sijaintia silloin kun muilla keinoilla ei päästä visualisoimaan erikseen diffraktiorajan alla olevia tuhansia proteiineja (2006). Signaalien keskuskohdat ja etäisyydet niiden välillä on määritettävissä.
On myös dual-color version tästä PALM teksniikasta.

Mikä merkitys tällaisella tarkuudella on?
Esim. perinteisellä mikroskooppitekniikalla on havaittu "selvästi samaan kohtaan lokalisoituvia proteiineja" ( colocalization), mutta nyt tämän tekniikan ilmestyttyä voidaan osoittaa esim proteiinien olevan "hyvin lähellä toisiaan, mutta eri molekyyli ryväksissä ( clusters) ". Tällainen tekniikka saattaisi osoittautua arvokkaaksi, kun ollaan ratkomassa viruksen ja isäntäsolun proteiinien välisiä oletettuja interaktioita. Kun jatketaan tällä lisääntyvän tarkkuuden tiellä nanometrisiä resoluutioita tavoitellen tullaan PALM-amalgamaatioon ja single-particle tracking metodiin, jota sanotaan sptPALM (2008).
Hyötyä on sptPALM menetelmän suuresta spatiaalisesta erotuskyvystä esim tutkittaessa plasmamembraanin tuhansien yksittäisen molekyylien käytöstä plasmamembraanin dynaaminen luonne visualisoituna. Kun käytetään yksittäisten molekyylien selekiivistä fotoaktivaatiota voidaan määritellä niitten vaikutusratoja hyvinkin pienillä solualueilla. Manley et al.(2008) käyttivät kombinoitua sptPALM tekniikkaa Gag molekyylien jäljittämiseen plasmamembraanissa aivan uskomattomalla tarkkuudella ja sitten he seurasivat eri partikkelialaryhmien liikkeitä käyttäen selektiivistä fotoaktivaatiota. Yksi kiinnostava löytö oli sekin, että Gag polyproteiinin liikkumaton osa pisti plasmamembraaniin. Tämän oletettiin johtuvan interaktiosta tetraspaniinirunsaan mikrodomaanin (TEM) kanssa. Täten Gag-dynamiikan eroavuuksia voitaneen edelleen tutkia käyttämällä dual colored PALM tekniikkaa tarkoituksella tutkia isäntäsoluproteiinien kanssa tapahtuvaa interaktiota.

• Mikä yhdistää Exit ja Entry tapahtumia?

Dendriittisoluilla (DC) on kyky sitoa HIV tulematta produktiivisesti infektoituneeksi, outo ilmiö, joka osaltaan vaikuttaa immuunivasteeseen ja samalla on kuitenkin vielä yksi isäntäkehon funktio, jonka HIV on kaapannut. DC solu voi sitoa ja hajoittaa HIV-virusta ja tuottaa vasta-aineita sitä kohtaan, se voi myös sekvestroida virusta ja kuljettaa sitä T-soluille ns trans-infektioprosessissa ja täten aiheuttaa osaltaan systeemisen infektion puhkeamista.
Ratkaisematon kysymys on: Missä tarkasti ottaen dendriittisolu varastoi virusta ennen kuin se toimittaa niitä pois T-solulle.
"Exosomi-malli" olettaa että dendriittisolu varastoi virusta suojatuissa aitioissa solun sisällä ja trans-infektoituminen pääsee tapahtumaan vain silloin kun fuusiossa plasmasolun kanssa virion joutuu takaisin pintaan.
Uudet tulokset osoittavat myös tätä vastustavan mallin olevan olemassa: Oletetaan että internalisoituneet virionit ovat hajonneet lysosomeissa ja vain pintaan pääseville virioneille on mahdollista aiheuttaa trans-infektoituminen.

On näyttöä kummankin oletuksen puolesta, mutta lopulta pystyttiin osoittamaan että virionit varastoituvat internaaliseen aitioon, joka on taskumainen, plasmamembraanin kanssayhteydessä oleva tila, josta käsin on mahdollisuus päästä pintaan.Tämä siis vastustaa trans-infektiomallin oletusta. Aktiinisytoskeleton, pinnasta rekrytoitu CD81 kertyivät samaan aitioon kuin internaalinen HIV, jolle aktiinirakenne oli välttämätön ulos pääsyyn.
Tällainen malli myös selittää, miksi solu pinnalle applikoitu inhibiittori ja nestefaasinen merkitsijä pääsi virionin aitioon. Samanlaista mekanismi on havaittu HIV leviämisessa infektoituneesta solusta uuteen kohdesoluun. Konfiguraatiota sanotaan virologiseksi synapsiksi. (2004)
Tästä on uudempaa tietoa:
http://jvi.asm.org/content/84/7/3516.short
infektoituneet solut ovat paljon tehokkaampia HIV levittäjiä verrattaeessa soluttomiin viruspartikkeliehin. Tätä pidettiin kauan mysteeriona, minkä nykyinen kombinoitu kuvantamistekniikka vasta on ratkaissut. Sellaiset interaktiot voivat olla kohtia, joissa plasmamembraani on suorassa kontaktissa näiden kahden solun kesken: infektoituneen ja uuden kohdesolun kesken. tai kontaktia välittää membraaniprojektiot kuten sytoneemit ja nanotuubit.
Kaikissa tapauksissa infektiivisyys stimuloituu, kun virus konsentroituu infektoituneesta viruksesta käsin läheiseen kontaktiin kohdesolun fuusioon vaadittavien reseptoreitten kanssa, jolloin uusi entry, viruksen sisäänmeno, pääsee tapahtumaan suoraan viruksen exit, ulosmenossa. .

• C. Säätely ja lisäproteiineista Tat ja Nef on myös uutta tietoa uudella tekniikalla.

Tat = transactivator of transcription protein of HIV
HIV viruksen transkriptiota trans-aktivoiva proteiini.
Se tehostaa viruksen RNA-synteesia vaikuttamalla trans-aktivaatiolle vastaavaan alueeseen TAR ( trans-activation-responsive region) viruksen RNA:ssa. Se myös tekee interaktiota solukomponenteihin. Se tekee interaktionsa vaikuttamalla P-TEBb tekijään, positiivisen transkription elongaasitekijään. P-TEBb kinaasikomponentti sykliini T1 tekee kompleksin TAR kanssa HIV viruksen promoottorilla Tat ja sykliiniT1 proteiinien interaktio tunnistettiin jo biokemiallisesti, mutta vasta FRET-menetelmä pystyi ideaalisti kuvantamaan tätä oletettua biokemiallista interaktiota ja määrittelemään sen fysiologisen relevanssin: Tat vaikuttaa solun sisäiseen sykliini T1-lokalisaatioon.
Normaalisti Sykliini T1 on tumatavara, kun taas Tat tyypillisesti asettuu diffuusisti kautta sekä nukleoplasman että tumahiukkasten nucleolus. Kun niitä on samassa kohtaa, ne tekevät uudelleenjärjestäytymisen. Tat vaikuttaa, että sykliini T1 asettuu toiseen paikkaan luonnollisesta akkumulaatiokohdastaan ja menee transkriptiokohtaan ja samalla Tat ei enää olekaan diffuusisti, vaan akkumuloituu samaan kohtaan. Sitten Tat ja sykliini T1 aktivoivat transkription, mikä oli jo tiedettykin ennen uutta tekniikkaa. Ennen täydellistä transkriptiota kuitenkin Tat irtautunee.

• Nef oligomerisaatio

HIV viruksen säätelyproteiini Nef on vaadittava tekijä HIV infektion pahenemisessa AIDS asteelle. Nef osallistuu säätämään vaimeaksi CD4 ja MCH-12 molekyylejä ihmisen solupinnalta, mikä seikka lisää infektiivisyyttä. Tätä Nef vaikuttaa tekemällä interaktioita monien ihmissoluproteiinien kanssa. Se tekee interaktion Hck proteiiniin ( proteiini-tyrosiinikinaasi), mikä seikka liittyy HIV patogeneesiin.
BiFC tekniikalla osoitettiin, että Nef oligomerisaatio tapahtuu elävässä solussa, mikä taas on edellytys, jota kehon Hck proteiini voi aktivoitua . Odotetaan lisää tietoja Nef interaktiosta isäntäkehon proteiinien kanssa. BiFC tekniikka on käytetty myös havaitsemaan mahdollisia interaktioita retroviruksen Gag polyproteiinin ja aktiinin kesken.

• Johtopäätöksenä

Tämän artikkelin kirjoittajat C M Danielsson ja T. Hope toteavat, että on menossa oikein vallankumous HIV replikaatioon osallistuvien solutekijöitten identifioimisessa.
siRNA ja shRNA kirjastot poistogeenisistä solutekijöistä ovat johtaneet satojen uusien tekijöitten multippeleitten ryhmien identifioimiseen ja niillä voi olla interaktiota HIV proteiinien kanssa ja essentielliä osuutta HIV biologiassa. Lähitulevaisuudessa tämä lista voi ainoastaan pidentyä.

Nykytekniikkaa on pystynyt tuottamaan runsasta informaatiota näitten interaktioitten funktionalisuudesta. Kuvantamisella saadaan valoa interaktioitten paikallistumiseen ja dynamiikkaan ja komplisoitujenkin kysymysten asettelujen ratkaisuja voidaan kombinoiduin metodein selvitellä. Kehittämällä huippuunsa näitä jo korkealaatuisia tekniikoita (high resolution imaging) (probing different stages of the viral life cycle) aikamme tiedemiehet ovat hyvin varustautuneena vastaamaan kysymyksiin HIV-1 virusproteiinien suhteesta ihmisen soluproteiinien miljööseen ja täten luomaan perustaa sellaiselle tiedolle, jota voidaan terapian luomiseen hyödyntää.
Päivitystä 23.2. 2015