Miten aktuelli on HIV tilanne maailmassa? Tämä on mielestäni pahan näköistä kartallakin

Vuonna 2013 sairasti  HIV/AIDS tautia  35 miljoonaa ihmistä ja vuuonna  2013 kuoli AIDS tautiin 1.5 miljoonaa ihmistä. Kartta esittää globaalin prevalnessin  prosentteina väestöstä .  Dominoivimmin  virusta kantaa Länsi ja Etelä sekä kaakkois-Afrikka. 4,5 % väestöstä.
 Jos Afrikan alueen väkiluku on  miljardin,  ja pohjoiset koilliset muslimialueet siitä puolet, muun osan   HIV- rasite on suuri. Ainakin  22.5 miljoonaa lähinnä ei muslimeista.

HIV, Rab-kaltaiset GTPaasit, motoriset proteiinit

P. Spearman et al. toimittamassa kirjassa on artikkeli HIV-1 Gag and host vesicular trafficking pathways (2009).

• Gag on virus proteiini, joka johtaa HIV-1 viruksen kokoontumisprosessia (assembly) uusiksi virioneksi.Gag rekrytoi solun mekanismeista rakkuloitten kuljetusjärjestelmän (host vesicular trafficking) käyttöönsä voidakseen vaeltaa kautta sytoplasman ja selviytyä virionpartikkeleitten kokoontumiskohtaan. Kokoontumiskohta on solun plasmamembraani ( makrofageissa myöhäinen endosomi)  (Tästä erikseen)

• Mitä erityistä plasmamembraani tarjoaa muodostuville virioneille? Siinä on paikoitellen hyvin kolesterolipitoisia kohtia lipid rafts ja plasman kaksoislipidikalvon sisälehdessä on lipositolifosfolipidiä PI(4,5)P2. (Tästä erikseen)

• Mitä tekijöitä tarvitaan virionin koostamisessa?

Tätä viruksen virionin tehtailua varten tarvitaan adaptoriproteiinikompleksia, proteiinien lajittelua ( sortteerausta) ja kierrätystä (recycle), monirakkulaisia komponentteja (multivesicular complexes) ja solun motorisia proteiineja kiihdyttämään HIV viruksen aineksien koostamista uusiksi virioneiksi.

Tässä Hin Chun et al. artikkelissa keskitytään tekemään yleiskatsausta rakkulaliikenteen tieverkosta ja kuvaamaan Gag-interaktiossa olennaiset komponentit. Sekä Gag että Env vaativat hyvin suojaavan endosomaalisen kuljetustien selvitäkseen tehtävissään solumiljöössä.
Tarvitaan adaptoriproteiinin (AP, TIP-47) johtamaa endosomaalisen kuljetuksen jaksoa
Rab proteiinit ja siihen liittyneet effektorit ovat alkaneet myös hahmottua.
Pi(4,5)P2 on tärkeä osallistuja virionin alkaessa silmukoitua ulos plasmakalvosta. Siinä tarvitaan ESCRT kompleksia ja Rab suorittaa kuljetuksia.

Gag-kuljetuksiin osallistunee lukuisia muitakin solutekijöitä.
Tulevaisuudessa arvellaan voitavan kohdistaa antiretroviraalista terapiaa tähän Gag proteiinin funktion alueeseen.

• Solun Rab-kaltaiset GTPaasit ja motoriset proteiinit viruksen palveluksessa
  

Rab-proteiinit ovat solun omia proteiineja ja kuuluvat pienten Ras-kaltaisten GTP-aasien superperheeseen. Nykyään tunnetaan 11 rabproteiinia hiivasta ja yli 60 ihmisen soluista (2001). Rab-proteiinit tekevät funktionsa rakkulakuljetusjärjestelmän alueella. Ensin ne ovat liukoisia sytosolin proteiineja ja sitten ne alkavat prenyloitua RGGTaasilla (Rab geranyyligeranyylitransferaasilla), jolloin niihin tulee 1-2 geranyyligeranyyli ryhmää (1994).
Rab proteiineilla on spesifistä toimintaa rakkuloitten tethering-prosessin aikana.
Sitten on havaittu niiden säätelevän rakkuloitten ja organellien liikettä pitkin sytoskeletonverkostoa interaktiossa moottoriproteiinien kanssa. Näitä mikrotubuloista riippuvaisia proteiineja ovat dyneiini ja kinesiini ja aktiinista riippuva proteiini on myosiini.

On osoittautunut , että RabGTPaasit osallistuvat retrovirusten kokoontumiseen.

Rab7 ja RILP
Rab7 ja sen effektoriproteiini RILP ( Rab7 interacting lysosomal protein) vaikuttavat HIV-1 viruksen kokoontumiseen. RILP yliexpressio johtaa HIV-1 Gag proteiinin perinukleaariseen, tumanvieriseen sijoittumiseen(2003 ).
Rab7 ja RILP osallistuvat rakkuloitten kuljetukseen myöhäisen endosomaalisen vaiheen (LE) aikana kohti MTOC ( mikrotubuluksia organisoivaa keskusta) prosessissa, joka riippuu dyneiinin motorisesta aktiivisuudesta. Tässä Rab7 ja RILP johtanevat endosomiin liittynyttä HIV-Gag proteiinia kohti tätä mikrotubulusten organisatorista keskusta. ( Siis solun alueelta kerätään viruksen kokoamismateriaalia kuin suppiloon tuman pinnan vierellä ja suppilot johtavat kohti solun ulkopintaa).

Rab11a ja Gag-Env- interaktio

Jos Rab11a oli dominantisti negatiivinen, se esti kapsidia menemästä plasmamembraaniin ja silmukoitumaan virioneiksi.
Arvellaan, että Rab11a on avaintekijä sallimassa endosytoidun Env proteiinin kierrättymään aitioon, missä Gag- Env interaktio tapahtuu ja liihdyttämässä kapsidin materian siirtämistä perinukleaarisesta alueesta.

Vaikka HIV ei muodostakaan solunsisäisiä epäkypsiä kapsideja kuten eräs toinen retrovirustyyppi, tulee mieleen, että HIV Gag voi ohimenevästi kulkeutua tai pidättyä perinukleaariseen alueeseen dyneiinistä riippuvalla tavalla, missä se voi kohdata endosytoitunutta HIV Env proteiinia adaptoriproteiinilla (AP) verhoutuneitten rakkuloitten avulla, jotka ovat mukana seuraavissa kuljetusvaiheissa.

KIF4
Toinen vaihtoehto on , että HIV Gag proteiini tai oligomeerivälituotteet voisivat asettua interaktioon kinesiinien kanssa  kuten KIF4.

Rab9 ja TIP47
Rabproteiineilla on muitakin rooleja ja niihin liittyneitä moottoreita HIV partikkelin keräämiseksi.
Yksi tällainen tärkeä proteiini on Rab9, RabGTPaasi, joka kiihdyttää lastin sitomista TIP47:n avulla ( tail-interakting protein). Jos Rab9 poistetaan solusta siRNA:lla, aiheutuu Gag - kertymiä soluihin ja vähenemää virioneitten irtoamisessa (2005).

Koska nämä Rab proteiinit näin rekrytoivat effektorimolekyylejä rakkuloitten kuljettamiseen, on todennäköisesti selvitettävä muitakin Rabproteiinien rooleja viruksen kokoontumisen eri vaiheissa.

JOS dyneiinimoottorit osallistuvat Gag-virusproteiinin pidättämiseen lähellä mikrotubuluksia organisoivaa keskusta, niin kinesiineillä voi olla ehkä osuutta Gag-proteiinin liikkeeseen kohti solun periferiaa. Yllämainitun kinesiinin KIF4 geenin knock down vaikutti alentunutta intrasellulaarista Gagproteiinipitoisuutta ja esti viruspartikkeleiden produktiota.
Päivitystä 23.2. 2015 
allal on kuva jossa mainitaan muutamia tämän artikkelin molekyylejä. 
http://www.cell.com/cms/attachment/2017946573/2038190796/gr2.jpg

Lukemattomat interaktiot HIV- viruksen ja isäntäsoluproteiinien kesken ( Springer)

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9
Paul Spearmanin kirjassa mainitaan sivulla 103 että HIV-1 virus elinsyklissään luottaa strategiassaan myriadeihin interaktioihin isäntäsoluproteiinien kanssa. Tämä tilanne asettaa valtavan haasteen tieteen tekniikalle. 

 Kappaleen otsikkona on
 Imaging of HIV/Host Protein Interaction, kirjoittajina C M Danielson et T J Hope

• Traditionaaliset biokemialliset lähestymistavat proteiini-proteiini-interaktioiden luotaamiseksi ovat kapasiteetiltaan rajoitettuja tutkimaan intaktin solun tilavuudellisia ja dynaamisia vuorovaikutuksia.

• Mutta fluoresoivin kuvausmenetelmin voidaan kuitenkin tutkia viruksen ja isäntäsolun proteiinien välisiä paikallistumisia ja dynaamisia interaktioita. Monta uutta fluoresointiin perustuvaa kuvaustekniikkaa on kehitelty viime vuosikymmenen aikana ja ne ovat olleet hyödyksi kuvattaessa HIV-1 virusproteiinien vuorovaikutusta isäntäsoluun.

• Tekniikat mitä tässä kirjassa otetaan esiin:( engl)Colocalization versus interaction; Probing association by energy transfer; Improving imaging condition by increasing sensitivity and resolution

• ESIMERKKEJÄ asioista mihin näillä uusilla menetelmillä on kohdistuttu ja mitkä tässä kappaleessa otetaan esiin. A. Viruksen sisäänmeno ( entry), B. Viruksen ulostulo ( exit) C. Säätely ja lisäproteiinit ( regulatory and accessory proteins)

JOHDANTO  mainitsee seuraavia seikkoja: Retrovirus HIV koodaa itselleen vain 15 proteiinia, mutta on kehittänyt huippuunsa isäntäsolun monien funktioiden anastamiskeinot. Niillä se hankkii itselleen sopivan miljöön elinsyklinsä täydellistämiseksi. Sillä on olemassa myriadit interaktiot, jotka suuntaavat uudelleen ja orjuuttavat isäntäsolun funktiota päämääränä onnistunut infektoiminen- ja isäntäsolun uupumus ja tuhoutuminen.Kun koetetaan selvitellä erilaisia molekulaarisia kohteita, joita voisi terapeuttisesti manipuloida, on tiedettävä viruksen komponenttien lisäksi myös löydetyt proteiini-interaktiot ovat merkityksellisiä vain, jos ne tapahtuvat in vivo. Jos sytoplasmassa ollut proteiini voisi rakenteellisesti tehdäkin interaktion tumaproteiinin kanssa, tällainen teoreettinen interaktio eri soluaitioista peräisin olevien proteiinien kesken on fysiologisesti irrelevanttia.
Biokemialliset tutkimukset voivat kyllä luonnehtia koeputkessa ( in vitro) joukoittain interaktioita, mutta uudet kuvaustekniikat visualisoivat interaktioita luonnollisina ja elävässä solussa.

ELÄVÄN SOLUN KUVANAMISTEKNIIKAT ovat minimaalisen invasiivisia lähestymistapoja kuvaamassa tarkemmin interaktioitten dynamiikka. Biokemiallisissa menetelmissä löydetyt proteiini-interaktiot ovat merkityksellisiä vain, jos ne tapahtuvat in vivo ( elävässä kehossa) . Jos sytoplasmassa ollut proteiini voisi rakenteellisesti tehdäkin interaktion tumaproteiinin kanssa, tällainen teoreettinen interaktio eri soluaitioista peräisin olevien proteiinien kesken on fysiologisesti irrelevanttia. Biokemialliset tutkimukset voivat kyllä luonnehtia koeputkessa ( in vitro) joukoittain interaktioita, mutta uudet kuvaustekniikat visualisoivat interaktioita luonnollisina ja elävässä solussa.
Kymmenen viime vuotta on lisännyt runsaasti tietoa ja tekniikkaa. Kirjaansa on Paul Spearman ottanut näistä tekniikoista kolme (yllämainittua) tarkemmin kuvattavaksi.
Sanoja mitä tekniikkaa kuvaavissa kappaleissa vilahtelee on mm
fluorescent microscopy, high resolution fluorescent imaging, laser scanning confocal microscopy, deconvolution microscopy, computer- based image restoration, digital cameras, spinning disc , fluorescence resonance energy transfer (FRET), bimolecular fluorescent complementation (BiFC), stimulated emission depletion (STED), photo-activated localization microscopy (PALM), total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy , traditional epifluorescence microscopy , evanescent field,
jne jne

• A. Mitä löytöjä on tehty viruksen soluunmenovaiheesta?
  

HIV-1 viruksen entry, sisäänmeno soluun. HIV menee CD4+Tyypin imusoluun sisälle sen jälkeen, kun virusvaipan (Envelope) glykoproteiini gp120 on sitoutunut CD4-reseptoriin, mikä sallii gp120 proteiinin tehdä interaktion ko-reseptoriin, joka on joko CCR5 tai CXCR4. Tällöin tapahtuu konformaation, struktuurin muutos.
http://2009.igem.org/wiki/images/d/d1/HIV_absorb_cd4_and_ccr5.png
Tämä struktuurinmuutos tuo esiin hydrofobisen fuusiopeptidin.  Fuusio viruksen vaipan ja ihmissolun plasmakalvon kesken tapahtuu. Fuusiossa pääsee viruksen sisällä oleva ydinkapsidi isäntäsolun sytoplasman elinnesteitten alueelle.
http://img.medscape.com/fullsize/migrated/editorial/conferences/2001/325/retro.04.gif
Kapsidin seinämäosat purkautuvat ns vaipasta vapautumistapahtumassa, uncoating -prosessissa ja sisällä oleva viruksen genominen aines, joka on kaksi (+)plus sense RNA-säiettä alkaa muuttua käänteiskopioivalla entsyymillä (RT) reversillä transkriptaasilla (RT),  DNA- kielelle ja viruksesta hahmottuukin nyt ds double strand DNA ja sitä kuljettava kompleksi PIC. (Sytoplasma ei siedä paljasta DNA:ta)

http://www.scielosp.org/img/revistas/aiss/v46n1/02f03.gif
http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/images/nrm1000_040a_f1.gif
VirusRNA mallista valmistettu rusi tuore dsDNA pakkautuu ja kapaloituu PIC- hahmoiseksi preintegraatiokompleksiksi, joka vie vastasyntyneen DNA:n ja useita viruksen tuomia proteiineja sekä solun proteiineja tumaan ja sitten tapahtuu alkuperäisin viraalin koodin DNA-kielisen hahmon integroituminen ihmisen kromosomistoon DNA:n joukkoon.
http://cochin.inserm.fr/research/scientific-departments/biocihp/team-berlioz-emiliani/nuclear-steps-of-hiv-1-replication/nuclear-steps-of-hiv-1-replication/images/Fig-1.jpg
Jos virus saa tehtyä tämän DNA-proviruksensa , se antaa ikuiset merkit ihmisen genomiin. Tässä vaiheessa infektiontekojärjestelmä voi sitten "hengähtää" ja olla latenttinakin, piilevänä.

Entry-prosessi luottaa hyvin lukuisiin interaktioihin isäntäsolun eri proteiinien kanssa, mistä (häikäilemättömästä ryöstöpolitiikasta) virus hankkii itselleen sekä  ( tässä ja nyt-)  hyödyn saada olla solun sytoplasmassa tuhoutumatta sekä pääsyn ihmisen tumaan DNA:n alueelle ( varmistaen lajitulevaisuuden) .

Näitten interaktioitten lokalisoitumisesta voidaan nykyisin helpommin saada tietoa fluoresoivilla menetelmillä.

• Mobiilit reseptorit entry-vaiheessa

Normaalisti HIV-sisäänmenon reseptorit sijaitsevat tiheämpinä tietyissä domaaneissa 10 nm toisistaan. Viruksen Envelope-vaippapinnan gp120 indusoi interaktion reseptorien väliin.
FRET menetelmällä 2006 arvioitiin gp120 interaktio CD4 ja CCR5 reseptorien välillä. Normaalisti nämä reseptorit muodostavat omat erilliset mikrodomaanit, mutta jos on gp120 tulossa, ne tekevät kompleksin gp120:n kanssa viruksen sisäänmenovaiheessa. Gp120 saattaa CD4 ja CCR5 reseptorit yhteen elävän solun plasmamembraanissa Nämä reseptorit lokalisoituvat viruksen sisäänmenolle tärkeisiin lipidilevykohtiin ja jos nämä lipidilevyt kemiallisesti rikottiin, blokeerautui viruksen gp120-indusoima signaali, mutta kolesterolin palauttaminen lipidilevyyn ennallisti sen.

• Fluoresoivalla merkitsijällä merkattuja viruksia on tutkittu.

Ensimmäiset elävällä solulla tehdyt tutkimukset suoritettiin 2002, jolloin HIV viruksen lisäproteiini Vpr oli merkattuna.Voitiin havaita, miten HIV menee soluihin ja kaappaa solun mikrotubulaarisen verkoston käyttöönsä voidakseen suorittaa matkan kohti solun tumaa. Virus oli tässä vaiheessa täysin riippuvainen solun sytoskeletonrakenteesta saavuttaakseen virusgenomin lopullisen päämäärän, ihmissolun tuman.
FRT menetelmällä on kuitenkin rajoituksensa. Esim. Vpr ilmeisesti katoaa kuvioista ennen kuin virusmateriaali on selviytynyt tumaan asti, joten osasta HIV elämänsykliä  ei voida kuvantaa tällä merkitsijällä.

• Viruksen sisäänmenon (Entry) fuusiotapahtuman erottaminen endosytoosista

Eräs parannus virionin merkkaukseen on ollut Src:n 15 N-terminaalisen seriinin S15 merkkaus. Tämä virukseen inkorporoitunut sígnaali katoaa fuusion jälkeen, mutta ei nonproduktiivisen reseptorista riippumattoman endosytoosin jälkeen. S15 kohdistaa plasmamembraaniin ja tämä sekvenssi inkorporoituu virioneihin. Kaksoismerkinnällä S15 ja GFP-Vpr saadaan selkeä kuva virionista, joka on tullut soluun fuusiolla ja on produktiivinen: viruksen sisäntulotapahtuma on produktiivinen. Tällä erotetaan nonproduktiiviset, epärelevantit virionit.
Kaksoismerkintää voidaan käyttää tutkittaessa retroviruksen restriktiotekijää rhTRIM5alfa, joka käy interaktioon sytoplasmisen HIV-kompleksin kanssa. TRIM5alfakompleksiin assosioituivat ne virionit, jotka olivat menettäneet S15-merkitsijäaineen ja tulleet isäntäsolun sytoplasmaan fuusiolla.

• Miten virus matkaa tumakeskukseen? IN- merkkaus , DNA

GFP-Vpr merkitsemisen rajoituksena on, että sillä voidaan kuvata vain varhaisia postentry-tapahtumia, eikä ollenkaan tumassa liikkumisia tai intrasellulaarisia HIV-kompleksin interaktioita.
Mutta yksi askel eteenpäin on ollut integraasientsyymin (IN) merkkaus. Vuonna 2006 se voitiin merkata (F1AsH-tagged integrase, fluorescein arsenical hairpin) ja näin saatiin visualisoitua tumansisäisiä liikkeitä.
Saatiin havaituksi HIV integraasin liikekinetiikasta kohti tumaa sen käyttävän mikrotubuluksista ja aktiinista riippuvaa liikkumista. HIV-kompleksit lokalisoituivat siinä systeemissä tumaan rajoitetulla diffuusilla liikkeellä.
Vuonna 2008 F1AsH-menetelmää oli parannettu käyttämällä fluorophore-tagged integrase in trans Koska paikalleenpistetyt sekvenssit provirussekvenssien sisällä usein aiheuttavat prosessointiongelmia, tutkijat hyödynsivät sitä faktaa, että Vpr on inkorporoituneena virioneihin ja liittivät Vpr-tekijän fluoresoivasti merkattuun integraasiin. Tämä tehtiin siten, että HIV-proteaasin ollessa läsnä pilkkoutuma tapahtui niin, että Vpr erosi IN-EGFP:sta, merkatusta integraasista. Täten Vpr-IN-EGFP ilmeni in trans proviruskonstruktion kanssa sisältäen IN- deleetion sallien virionin produktion fluoresoivalla merkatulla integraasilla.

Albanese, jonka menetelmä tämä oli, tutki pikemminkin HIV viruksen suhdetta isäntäsolun DNA:han eikä niinkään isäntäsolun proteiineihin. Kun tutkittiin integroitumisen kohtia, paljastui HIV viruksen taipumus ensisijaisesti integroitua aktiivisti transkriboituviin geeneihin. Avoimen kysymyksenä on, mikä määrää tämän integroitumiskohdan suosituimmuuden. He havaitsivat myös, että virionit eivät tapaa vaellella pitkälle tumaan saapumisen jälkeen ja suosituimmuudet on etsittävä purkautuneitten (dekondensoituneitten) kromatiinien alueelta. Tämä on vasta löytöjen alkua siitä, mihin genomikohtiin HIV assosioituu, mutta avaa monia näkymiä jatkotutkimuksiin tumansisäisistä interaktioista.

• B. Entä miten virion lähtee solusta ulos (Exit)

Kun virus on integroinut sen käänteiskirjoitetun genominsa DNA:n isäntäsolun genomiin, muodostunut provirus toimii templaattina,  josta sitten voi tavalliseen tapaan transkriboitua RNA:ta
Nyt alkaa sitten viruksen proteiinien syntetisoiminen ( HUOM: aivan kuin solun omatkin proteiinit. Ensin lähettiRNA, mRNA, joka menee sytoplasmaan ja etsii sopivat tRNA:t ja ribosomeilla translatoituu peptidiketjuiksi ja proteiineiksi. Näitä proteiineja sitten kokoontuu (Assembly) viruksen säätämässä sekvenssissä solun plasmakalvon lähelle ja silmukoituu epäkypsinä virioneina infektoidusta solusta ulos. Tässä on avuliaasti apuna isäntäsolultta kaapatut järjestelmät: endosomaalisen lajittelun kompleksi, jota virus tarvitsee tuotteen kuljetuskoneistossa (ESCRT) kulkeutumiseen. Epäkypsät virionit suorittavat kypsymisen ja sitten ovat valmiina infektoimaan muita kohdesoluja. Kuvantamistekniikat ovat antaneet paljon tärkeää uutta tietoa uusien virioneitten koostamisen interaktioista ja dynamiikasta.

Korreloiva kuvantamistekniikka ( Correlative Imaging). Fluoresoivalla merkkiaineella merkatut viriot sopivat soluun menoa (entry) koskevien seikkojen tutkimuksen, mutta muita metodeita on käytettävä kuvaamaan nuppuilevan (budding) virionin ulosmenoa (egres).Tässä on kombinoitava tekniikkoja. Verrataan high-resolution electron microscopy tekniikkaa ja fluoresoivaa kuvantamistekniikka visualisoitaessa molekyylejä solun sisätilassa. Tällä voi visualisoida retrovirusvirionin nuppuilun
Lisäksi voidaan hyödyntää transfektoidun Gag -polyproteiinin multifotoni laser scanning mikroskopiaa (MPM) ja jatkossa scannin electron microscopy-tekniikkaa (SEM). SEM voi nähdä yksittäiset nuppuilut, mutta on käytettävissä vain pinnan kuvaukseen. Fluoresoiva tekniikka voi kuvantaa vain solun sisällä olevaa ja virionin silmukoitumisen voi vain päätellä fluoresenssin katoamisesta.
On tutkittu myös yksittäisten partikkelien menemistä solun sisään
Larson et al. on visualisoinut elävissä soluissa mm. yksittäisen HIV-1 viruksen nuppuilun, virus like particles (VLP) ym. ja vertaillut fluoresoivissa tekniikoissa saatuja tuloksia SEM tuloksiin.

• ESCRT eskortti mikrodomaanien kautta.Tetraspaniini

Aiemmin fluoresenssimikroskopialla oli havaittu HIV- partikkelin tekevän interaktion tetraspaniinin CD63 ja HIV Gag - polyproteiinin välille. Asian funktionaalista merkitystä ei kuitenkaan voitu käsittää. Tavallisessa yksinkertaisessa värjäyksessä vain pieni osa CD63:sta sijaitsee plasmakalvossa ja suurin osa sijaitsee intrasellulaarisissa kalvoissa (2003)  Seuraava askel tämän interaktion tutkimuksessa oli vuodelta 2006. Interaktion jatkotutkimuksissa selektiivisesti värjätty pinta-CD63 esiintyi ryväksittäin mikrodomaaneissa eikä tasaisesti jakaantuneena kautta plasmakalvon.
Korkean resoluution immunoelektromikroskopialla kombinoituna fluoresoivaan kuvantamiseen voitiin nähdä elävässä solussa tetraspaniinin rikastamat mikrodomaanit (TEM) .
TEM mikrodomaanit muodostuivat lähellä clathriinilla katettuja alueita ja sytoskeletaalisia elementtejä.
Osoittautui, että ESCRT1 komponentit Tsg101 ja Vps28 (joita vaaditaan virionin nuppuiluun), rekrytoidaan TEM:eille, joka sijaitsee samassa kuin Gag ( colocalization)

• Koneiston jaettu käyttö

Vaikka on hyvin, hyvin paljon tutkittu HIV-1 virioneitten ulospurkaantumista solusta, on asiassa varmaan jotakin löydettävää myös fluoresenssi mikroskooppitutkimuksissa.
Traditionaalisissa co-lokalisaatiotutkimuksissa havaittiin solukoneiston jaettua käyttöä viruksen ulospurkautumisen ja solun sytokineesin kesken. Vuonna 2007 hiivassa havaittiin ESCRT - koneiston ja sytokineesikoneiston komponenttien interaktioita ja fluoresenssimikroskopialla tutkittiin näitten oletettujen interaktioiten paikallistumisia.
http://www.nature.com/nrmicro/journal/v5/n12/fig_tab/nrmicro1790_F2.html
ESCRT proteiinit Tsg101 ja Alix sitovat sentrosomaalista proteiinia Cep55,. joka osallistuu sytokineesiin. Kun Cep55 expressio katkistaan siRNA:lla eivät Tsg101 eikä Alix enää sijaitse tavallisilla paikoillaan. Tutkijat kartoittivat Tsg101 aminohapot vastaamaan sitoutumisesta Cep55 proteiiniin ja havaitsivat deleetiolla tapahtuvan saman poikkeavan lokalisoitumisen. Kun he havaitsivat tämän silmänpistävän esimerkin viruksen tavasta anastaa niinkin tärkeä solun basaalifunktioitten kuin solunjakautumisen koneisto , he löysivät Tsg101-Cep55 interaktion olevan välttämätön sytokineesille, mutta ei viruksen ulosnuppuilulle.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17853893
Tutkimalla eri komponenttien vaatimuksia rekvisiittoina toimivissa solufunktioissa jotka virus on valjastanut replikaatioonsa, saattaisi olla mahdollista erotella spesifisiä interaktioita, jotka voitaisiin antivirusterapialla keskeyttää säilyttämällä samalla tarvittavat solutoiminnot.

• Virusten kaltaisten kappaleitten ulospurkaantumisen dynamiikkaa.

TIRF (Total internal reflection fluorescence ) on myös metodi virionmateriaalin kokoontumisen ja ulospääsyn kuvantamisessa. Vuonna 2008 tehtiin TIRF kuvantamisen kombinointi FRET:n kanssa ja f(uoresecnce recovery after photobleaching) FRAP- objektiivisempina metodeina interaktioitten määrittämiseksi viruksen purkaantumistutkimuksissa.
TIRF salli tutkijoitten kuvantaa Gag VLP purkaantumista reaaliajassa, mikä on vaikea tehtävä epifluoresenssissa, koska sytoplasmisen Gag-peräisen signaalin vahvuus voittaa heikon purkautumassa olevan VLP partikkelin signaalin. TIRF kuvantaa noin 100 nm alueelta.
Kinetiikkaa tutkittaessa havaittiin kahta sorttia Gag-populaatiota. Oli hitaasti ilmaantuvaa ja nopeasti ilmaantuvaa katoavaa. Käytettiin endosomaalisena merkitsijänä CD63. Nopeasti ilmenevä ja katoava Gag värjäytyi positiivisesti sekä CD63:lle että clathriinille, joten tämä populaatio liittyi endosomeihin. Niinpä he fokusoituivat hitaasti ilmenevään populaatioon, jota oli plasmakalvossa eniten edustettuna. TIRF teki mahdolliseksi karakterisoida näitä kineettisesti erilaisia Gag-populaatioita.
Sitten he käyttivät FRET metodia tulkkaamaan hitaasti pintaan nousevia partikkeleita Gag- molekyyleinä, jotka lähenevät toisiaan ja täten ovat käymässä läpi kokoontumistaan viruksen kaltaisiksi partikkeleiksi VLP.
Samantapaista FRET- metodiin perustuvaa menetelmää on hyödynnetty Gag-polyproteiinin oligomerisaatiotutkimuksissa. sekä elävässä solussa että viruksen kaltaisissa partikkeleissa (2004).
Vaikka Juvenetin tutkimus (TIRF, 2008) kohdistui primääristi virionin purkaantumisen dynamiikkaan, sitä voisi kokeilla lupaavana lähestysmistapana luonnehdittaessa prosessin aikaisia interaktioita, kuten soluproteiinien inkorporoitumista ja viraalin RNA:n inkorporoitumista purkaantuvaan virioniin.

• Superresolution budding- nanometrien tarkkuutta

Betzig et al ( 2006) raportoivat PALM menetelmän käytöstä (photoactivated localization microscopy). Tässä pystytään teoreettisesti erottamaan molekyylejä muutaman nanometrin tarkkuudella. Se ei lisää optista resoluutiota, mutta sallii fluoresoivien signaalien etäisyyksien alajaksojen mittauksen. Sekventiaalisella fotoaktivaatiolla ja subsekventiaalisella photobleaching menetelmällä voidaan määritellä lukuisten molekyylien sijaintia silloin kun muilla keinoilla ei päästä visualisoimaan erikseen diffraktiorajan alla olevia tuhansia proteiineja (2006). Signaalien keskuskohdat ja etäisyydet niiden välillä on määritettävissä.
On myös dual-color version tästä PALM teksniikasta.

Mikä merkitys tällaisella tarkuudella on?
Esim. perinteisellä mikroskooppitekniikalla on havaittu "selvästi samaan kohtaan lokalisoituvia proteiineja" ( colocalization), mutta nyt tämän tekniikan ilmestyttyä voidaan osoittaa esim proteiinien olevan "hyvin lähellä toisiaan, mutta eri molekyyli ryväksissä ( clusters) ". Tällainen tekniikka saattaisi osoittautua arvokkaaksi, kun ollaan ratkomassa viruksen ja isäntäsolun proteiinien välisiä oletettuja interaktioita. Kun jatketaan tällä lisääntyvän tarkkuuden tiellä nanometrisiä resoluutioita tavoitellen tullaan PALM-amalgamaatioon ja single-particle tracking metodiin, jota sanotaan sptPALM (2008).
Hyötyä on sptPALM menetelmän suuresta spatiaalisesta erotuskyvystä esim tutkittaessa plasmamembraanin tuhansien yksittäisen molekyylien käytöstä plasmamembraanin dynaaminen luonne visualisoituna. Kun käytetään yksittäisten molekyylien selekiivistä fotoaktivaatiota voidaan määritellä niitten vaikutusratoja hyvinkin pienillä solualueilla. Manley et al.(2008) käyttivät kombinoitua sptPALM tekniikkaa Gag molekyylien jäljittämiseen plasmamembraanissa aivan uskomattomalla tarkkuudella ja sitten he seurasivat eri partikkelialaryhmien liikkeitä käyttäen selektiivistä fotoaktivaatiota. Yksi kiinnostava löytö oli sekin, että Gag polyproteiinin liikkumaton osa pisti plasmamembraaniin. Tämän oletettiin johtuvan interaktiosta tetraspaniinirunsaan mikrodomaanin (TEM) kanssa. Täten Gag-dynamiikan eroavuuksia voitaneen edelleen tutkia käyttämällä dual colored PALM tekniikkaa tarkoituksella tutkia isäntäsoluproteiinien kanssa tapahtuvaa interaktiota.

• Mikä yhdistää Exit ja Entry tapahtumia?

Dendriittisoluilla (DC) on kyky sitoa HIV tulematta produktiivisesti infektoituneeksi, outo ilmiö, joka osaltaan vaikuttaa immuunivasteeseen ja samalla on kuitenkin vielä yksi isäntäkehon funktio, jonka HIV on kaapannut. DC solu voi sitoa ja hajoittaa HIV-virusta ja tuottaa vasta-aineita sitä kohtaan, se voi myös sekvestroida virusta ja kuljettaa sitä T-soluille ns trans-infektioprosessissa ja täten aiheuttaa osaltaan systeemisen infektion puhkeamista.
Ratkaisematon kysymys on: Missä tarkasti ottaen dendriittisolu varastoi virusta ennen kuin se toimittaa niitä pois T-solulle.
"Exosomi-malli" olettaa että dendriittisolu varastoi virusta suojatuissa aitioissa solun sisällä ja trans-infektoituminen pääsee tapahtumaan vain silloin kun fuusiossa plasmasolun kanssa virion joutuu takaisin pintaan.
Uudet tulokset osoittavat myös tätä vastustavan mallin olevan olemassa: Oletetaan että internalisoituneet virionit ovat hajonneet lysosomeissa ja vain pintaan pääseville virioneille on mahdollista aiheuttaa trans-infektoituminen.

On näyttöä kummankin oletuksen puolesta, mutta lopulta pystyttiin osoittamaan että virionit varastoituvat internaaliseen aitioon, joka on taskumainen, plasmamembraanin kanssayhteydessä oleva tila, josta käsin on mahdollisuus päästä pintaan.Tämä siis vastustaa trans-infektiomallin oletusta. Aktiinisytoskeleton, pinnasta rekrytoitu CD81 kertyivät samaan aitioon kuin internaalinen HIV, jolle aktiinirakenne oli välttämätön ulos pääsyyn.
Tällainen malli myös selittää, miksi solu pinnalle applikoitu inhibiittori ja nestefaasinen merkitsijä pääsi virionin aitioon. Samanlaista mekanismi on havaittu HIV leviämisessa infektoituneesta solusta uuteen kohdesoluun. Konfiguraatiota sanotaan virologiseksi synapsiksi. (2004)
Tästä on uudempaa tietoa:
http://jvi.asm.org/content/84/7/3516.short
infektoituneet solut ovat paljon tehokkaampia HIV levittäjiä verrattaeessa soluttomiin viruspartikkeliehin. Tätä pidettiin kauan mysteeriona, minkä nykyinen kombinoitu kuvantamistekniikka vasta on ratkaissut. Sellaiset interaktiot voivat olla kohtia, joissa plasmamembraani on suorassa kontaktissa näiden kahden solun kesken: infektoituneen ja uuden kohdesolun kesken. tai kontaktia välittää membraaniprojektiot kuten sytoneemit ja nanotuubit.
Kaikissa tapauksissa infektiivisyys stimuloituu, kun virus konsentroituu infektoituneesta viruksesta käsin läheiseen kontaktiin kohdesolun fuusioon vaadittavien reseptoreitten kanssa, jolloin uusi entry, viruksen sisäänmeno, pääsee tapahtumaan suoraan viruksen exit, ulosmenossa. .

• C. Säätely ja lisäproteiineista Tat ja Nef on myös uutta tietoa uudella tekniikalla.

Tat = transactivator of transcription protein of HIV
HIV viruksen transkriptiota trans-aktivoiva proteiini.
Se tehostaa viruksen RNA-synteesia vaikuttamalla trans-aktivaatiolle vastaavaan alueeseen TAR ( trans-activation-responsive region) viruksen RNA:ssa. Se myös tekee interaktiota solukomponenteihin. Se tekee interaktionsa vaikuttamalla P-TEBb tekijään, positiivisen transkription elongaasitekijään. P-TEBb kinaasikomponentti sykliini T1 tekee kompleksin TAR kanssa HIV viruksen promoottorilla Tat ja sykliiniT1 proteiinien interaktio tunnistettiin jo biokemiallisesti, mutta vasta FRET-menetelmä pystyi ideaalisti kuvantamaan tätä oletettua biokemiallista interaktiota ja määrittelemään sen fysiologisen relevanssin: Tat vaikuttaa solun sisäiseen sykliini T1-lokalisaatioon.
Normaalisti Sykliini T1 on tumatavara, kun taas Tat tyypillisesti asettuu diffuusisti kautta sekä nukleoplasman että tumahiukkasten nucleolus. Kun niitä on samassa kohtaa, ne tekevät uudelleenjärjestäytymisen. Tat vaikuttaa, että sykliini T1 asettuu toiseen paikkaan luonnollisesta akkumulaatiokohdastaan ja menee transkriptiokohtaan ja samalla Tat ei enää olekaan diffuusisti, vaan akkumuloituu samaan kohtaan. Sitten Tat ja sykliini T1 aktivoivat transkription, mikä oli jo tiedettykin ennen uutta tekniikkaa. Ennen täydellistä transkriptiota kuitenkin Tat irtautunee.

• Nef oligomerisaatio

HIV viruksen säätelyproteiini Nef on vaadittava tekijä HIV infektion pahenemisessa AIDS asteelle. Nef osallistuu säätämään vaimeaksi CD4 ja MCH-12 molekyylejä ihmisen solupinnalta, mikä seikka lisää infektiivisyyttä. Tätä Nef vaikuttaa tekemällä interaktioita monien ihmissoluproteiinien kanssa. Se tekee interaktion Hck proteiiniin ( proteiini-tyrosiinikinaasi), mikä seikka liittyy HIV patogeneesiin.
BiFC tekniikalla osoitettiin, että Nef oligomerisaatio tapahtuu elävässä solussa, mikä taas on edellytys, jota kehon Hck proteiini voi aktivoitua . Odotetaan lisää tietoja Nef interaktiosta isäntäkehon proteiinien kanssa. BiFC tekniikka on käytetty myös havaitsemaan mahdollisia interaktioita retroviruksen Gag polyproteiinin ja aktiinin kesken.

• Johtopäätöksenä

Tämän artikkelin kirjoittajat C M Danielsson ja T. Hope toteavat, että on menossa oikein vallankumous HIV replikaatioon osallistuvien solutekijöitten identifioimisessa.
siRNA ja shRNA kirjastot poistogeenisistä solutekijöistä ovat johtaneet satojen uusien tekijöitten multippeleitten ryhmien identifioimiseen ja niillä voi olla interaktiota HIV proteiinien kanssa ja essentielliä osuutta HIV biologiassa. Lähitulevaisuudessa tämä lista voi ainoastaan pidentyä.

Nykytekniikkaa on pystynyt tuottamaan runsasta informaatiota näitten interaktioitten funktionalisuudesta. Kuvantamisella saadaan valoa interaktioitten paikallistumiseen ja dynamiikkaan ja komplisoitujenkin kysymysten asettelujen ratkaisuja voidaan kombinoiduin metodein selvitellä. Kehittämällä huippuunsa näitä jo korkealaatuisia tekniikoita (high resolution imaging) (probing different stages of the viral life cycle) aikamme tiedemiehet ovat hyvin varustautuneena vastaamaan kysymyksiin HIV-1 virusproteiinien suhteesta ihmisen soluproteiinien miljööseen ja täten luomaan perustaa sellaiselle tiedolle, jota voidaan terapian luomiseen hyödyntää.
Päivitystä 23.2. 2015 

HIV-1 ja tetraspaniini (Springer kirjasta)

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9
Paul Spearman ja Eric O.Freed kirjassaan HIV Interactions with Host Cell proteins (2009) ovat katsoneet aiheelliseksi ottaa  kirjan yhdeksään  artikkeliin yhden, joka käsittelee tetraspaniinien osuutta . Sivulla 85 - 102 ( Näistä viisi sivua on tiheästi lueteltuja viitteitä asiasta. Muu sisältö on hahmoteltu seuraavsta:)

 (5) Mikä osuus on tetraspaniineilla  HIV-1 replikaatiossa?

(5) Thali Markus. The roles of tetraspanins in HIV-1 replication (Ss. 85- 102)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thali%20Markus.%20The%20roles%20of%20tetraspanins%20in%20HIV-1%20replication

TIIVISTELMÄ. Tetraspaniinit ovat pieniä integraalisia kalvoproteiineja, joiden tunnetaan kontrolloivan useita  erilaisia kalvoprosesseja kuten signalointia, migroitumista ja solu-solu-fuusioita.  On havaittu niiden myös säätelevän  HIV-1 replikaatiosyklissä   erilaisia vaiheita, mutta  tarkemmin ei ole tiedetty, miten nämä proteiinit pystyvät tehostamaan tai vaimentamaan viruksen leviämistä.
Tetraspanins are small integral membrane proteins that are known to control a variety of cellular processes, including signaling, migration and cell-cell fusion. Research over the past few years established that they are also regulators of various steps in the HIV-1 replication cycle, but the mechanisms through which these proteins either enhance or repress virus spread remain largely unknown.
Suomennos 23.2. 2015  
Kts: 
http://en.wikipedia.org/wiki/Tetraspanin

 Springerin kirjan tetraspaniinia käsittelevän artikkelin  SISÄLTÖ
Abstrakti (ullä)
1.Johdanto
2. Tetraspaniinit: Solukalvoon perustuvien prosessien organisaattori
(Rakenne, sijoittuminen solun sisällä; solufunktiot)
3. Tetraspaniinit säätelevät HIV-1 viruksen replikaatiota
Tetraspaniineja esiintyy viruksen ulosmenokohdilla
Tetraspaniinit HIV-1 viruksen virionissa estää Env- indusoiman kalvofuusion
Tetraspaniinit säätelevät HIV-1 viruksen sisäänmenoa ja virusgenomin transkriptiota vastainfektoituneissa soluissa.
Tetraspaniinit säätelevät solusta soluun tapahtuvaa HIV-1 viruksen välittymistä.
Miten tetraspaniinit säätelevät HIV-1 viruksen sisäänmenoa, viruksen proteiinien expressoitumista ja Env/reseptorivälitteisen fuusioprosessin?
Repression liipaisee esiin virukseen liittynyt Env tai tuottajasoluun liittynyt Env
4. Yhteenveto ja asian perspektiivit.

...Tästä asiasta katson yhteenvedosta jonkin lauseen:

"Pitäisi olla ilmiselvää em artikkeleitten johdosta, että olemme vasta tiedon varhaisissa alkujuurissa koettaessamme ymmärtää sitä mekanismia, millä tetraspaniinit vaikuttavat HIV-1 viruksen replikaation eri vaiheissa. On hyvä saada edelleen geneettisiä, biokemiallisia ja solubiologisia analyysejä tästä asiasta. Saadaan samalla jopa lisätietoa solufuusioprosessin fysiikasta analysoitaessa, miten tetraspaniinit säätelevät HIV-1 Env-liipaisemaa kalvofuusioprosessia virologisessa synapsissa. Nimittäin kaksi sileää toisiaan vastassa olevaa kalvoa eivät niin vain spontaanisti ala fusoitua (sulaa yhteen). Kuitenkin kaareva kalvopinta (kuten rakkuloissa tai mikrovillusten kärjissä) saattaa asettua lähempään kontaktiin vastapäisen sileän kalvon suhteen, koska repulsiovoimatkin ovat vähemmät näitten välillä ja voitettava energiaeste on matalampi. Tetraspaniinit toimivat kuin organisaattorit fuusioalustoilla joko sallien tai ollen sallimatta solun ja viruksen fusogeenien pääsyn kalvon näille mikrosegmenteille. Tetraspaniinit myös rekrytoivat sellaisia soluproteiineja ja lipidejä, jotka edistävät lipidikerrosten kaarevuutta.
Ei tule olemaan helppoa eritellä tarkalleen, miten tetraspaniini säätelee HIV-1 viruksen välittymistä, sillä tetraspaniineja on virologisen synapsin molemmilla puolilla sekä myös virionin sisällä.
http://www.metapathogen.com/IMG/HIV-infectious-synapse.jpg

Lisäksi on muistettava viruksen välittymistavan tapahtuvan imusolmukkeissa primääristi staattisen solukirjon kesken (solusta soluun), mutta tiedemiehet tietävät hyvin vähän viruksen leviämistavoista solusta soluun muissa kudoksissa esim suolistoon liittyvässä imukudoksessa. Kuitenkin voi pitää hyvin todennäköisenä liikkuvien (motile) HIV-1 infektoituneitten solujen toimivan viruksen välittäjälähteenä joissain tuollaisissa muissa paikoissa. Lopulta näyttäisi tulevan aivan ehdottoman välttämättömäksi tutkia tetraspaniinin funktioita sellaisissa olosuhteissa, mitkä heijastavat mainittuja fysiologisia seikkoja-ja vielä enemmänkin välttämätöntä, kun ottaa huomioon tetraspaniinien CD63 tai CD9 ja CD81 myös säätelevän solun motiliteettia, mikä puolestaan ehkä vaikuttaa HIV-1 viruksen leviämistä kohdesoluun ja samalla viruksen yleistymistä ( virus dissemination in situ).
---
Tetraspaniinin solufunktioista muutama lause:
Fuusion promoottoreina pidetään CD9 ja CD81 tetraspaniineja, mutta ne voivat kuten yleensä tukiproteiinit joko säädellä negatiivisesti tai positiivisesti fuusioilmiötä. Esim lihassolun myotubien muodostuksessa nämä kiihdyttävät lihassolujen fuusiota. Samoin ne kiihdyttävät itusolujen fuusiota (oosyytin ja sperman fuusiota ). Negatiivista säätöä on osoitettu mikrobeja sisäänsäottaneitten multinukleaaristen fagosyyttien muodostumisesta.

HIV-1 virioneihin on pakkautunut mukaan myös tetraspaniinia CD63. HIV-1 esiintyy solukalvon niissä segmenteissä, missä on runsaasti tetraspaniineja. On havaittu että tetraspaniinin C63 asettuminen virioniin ei ole umpimähkäinen, vaan non-random prosessi. kuten on havaittu HLA-DR antigeenista niin tetraspaniini CD63 inkorporoituu spesifisesti T-imusoluista vapautuneisiin virioneihin.Tämä havaittiin jo 1997. Tetraspaniinin identifioitiin uudestaan ( 2004) mahdollisena osatekijöinä HIV-1 replikaatiossa, kun tutkittiin virionin purkaantumista solusta ulos ja miten virus rekrytoi solun ESCRT-koneiston, joka välittää solusta vapautumista.
(ESCRT= endosomal sorting complex required for transport).

 HIV-1, erityisesti viruksen kalvon (envelope) glykoproteiini Env, ainakin joissan fysiologisissa tiloissa ja tietyissä solutyypeissä voi kulkea solun endosyyttisen järjestelmän niiden alayksikköjen kautta, joissa tetraspaniinin CD63 tiedettiin primääristi sijaitsevan. Virus hankkii itselleen CD63 kulkiessaan tätä purkautumistietä. Jos se purkautuu makrofagista, se on hankkinut lisäksi CD81 ja CD82.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19143627

Kriittinen seikka HIV-1 viruksen vapautumiselle on ESCRT1- kompleksin erään alayksikön (TSG101, tumor susceptibility gene 101 ) komponentti, koska sitä vaaditaan myöhäisen endosomin ja multivesikulaarisen (MVB) kappaleen lumenin sisäisten rakkuloitten muodostamiseen.

Myöhäisen endosomin (Late Endosome, LE) klassiset merkit ovat CD63, CD81 ja CD82, Lamp-1 ja MHC II. Polyproteiinin Gag asettuu näihin solunsisäisiin aitioihin. Kyse on sorteerauskohdasta, josta menee tiet lysosmiin, hajoitukseen tai pois solusta. Mutta gag välttää hajoituksen. Solun ulkopuolella olevat virionitkin kantavat LE/MVB merkkiaineita., joten LE-/MVB on produktiivinen ulospäin nuppuilu kohta. Gag rekrytoi ESCRT osatekijöitä MVB kappaleilta AP-3 taas tunnetaan Gag polyproteiinin kuljettajana LE-MVB alueelle. Adaptoriproteiini AP-3 kuljettaa aineita joissa on merkki CD 63 ja LAMP-1. AP-3 kompleksi on solun normaaleja avainproteiineja, jotka sorteeraavat sekretorisen ja endosyyttisen tien protiineja - kuin postinkantajat, katsomalla vain "osoitelapun" eikä sisältöä. Ne voidaan hämätä käyttämällä normaaleja osoitelappuja, sopivia CD-tunnuksia. niiden osuudesta pitäisi tehdä tässä  sivuhyppy. Adaptoriproteiinit.

Tetraspaniinit taas ovat niitä CD tekijöitä, osoitelappuja, joiden sopivan koostumuksen hankkiminen on kriittisesti tärkeää HIV-1 virukselle, että se pääse kamouflage periaatteella läpi sytosolin eikä joudu hajoitettavaksi.
http://www.cytochemistry.net/cell-biology/recend8.gif
http://www.nature.com/nm/journal/v9/n10/images/nm1003-1262-F1.gif

 Päivitys  23.2. 2015

HIV-1 Gag, Virionin koostaminen, Lipidraft, PIP2, (Springer kirjasta)

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9

 (4) HIV-1  Gag ja  isäntäsolun kalvorakkuloita kuljettavat tiet 

(4) Chu Hin, Wang Jaang-Jiun, Spearman Paul. Human Immunodeficiency Virus type-1 Gag and host vesicular trafficking pathways (Ss. 67- 84)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chu%20Hin%2C%20Wang%20Jaang-Jiun%2C%20Spearman%20Paul.%20Human%20Immunodeficiency%20Virus%20type-1%20Gag%20and%20host%20vesicular%20trafficking%20pathways

 TIIVISTELMÄ 

HIV-1 viruksen Gag- niminen proteiini toimii johtajana  uusien  viruspartikkeleitten kokoamisprosessissa. Gag rekryteeraa sen takia  isäntäsolujen oman  kalvorakkuloita kuljettavan koneisto , jotta pystyy  liikennöimään  solusytoplasman kautta ja päätymään uusien virioitten kokoontumiskohtaan. Useimmissa solutyypeissä  on uusien viruspartikkeleitten ensisijainen kokoontumiskohta  isäntäsolun plasmakalvo, mutta makrofageissa ( syöjäsoluissa)  on tämän vallitsevan  plasmamembraani- kokoontumisen ohella havaittavissa  myöhäisiin endosomeihin kertymistä, ja ne taas ovat solun sisäisiä kalvoaitioita .
Plasmamembraaniin kokoontumisen spesifisyyttä saattanee ohjailla lipidilevykomponentit ( lipid rafts)  ja sytoplasmisen kalvolehden komponentti PIP2. ( eräs kalvon fosfoinositidimolekyyli)
HIV- viruksen  kokoontumista ja viruksen ulospurkaantumista  tehostamassa  on havaittu myös osuutta adaptoriproteiinikomplekseilla, samoin proteiinien lajittelulla ja uudelleen kierrättämisellä, monirakkulaisten kappaleitten  komponenteilla ja solumoottoriproteiineilla Otsikon artikkeli esittää yleisnäkymää relevanteista  rakkulankuljetusteistä  ja kuvaa niitä  yksittäisiä komponentteja, joita on havaittu  olevan  interaktiossa Gag- proteiinin kansa.

Abstract
The Gag protein of HIV-1 directs the particle assembly process. Gag recruits components of the cellular vesicular trafficking machinery in order to traverse the cytoplasm of the cell and reach the particle assembly site. The plasma membrane is the primary site of particle assembly in most cell types, while in macrophages an unusual intracellular membrane-bound compartment bearing markers of late endosomes and the plasma membrane is the predominant assembly site.
 Plasma membrane specificity of assembly may be directed by components of lipid rafts and the cytoplasmic leaflet component PI(4,5)P(2).
 Recent work has highlighted the role of adaptor protein complexes, protein sorting and recycling pathways, components of the multivesicular body, and cellular motor proteins in facilitating HIV assembly and budding. This review presents an overview of the relevant vesicular trafficking pathways and describes the individual components implicated in interactions with Gag.

Suomennos 23.2. 2015 

HIV-1, SIV-1 ja TRIM5alfa, (restriktioproteiini ( Springer kirjasta)

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9 Sivut 2004
Kirjan sisällöstä
Toimittajien alkulause 2009.

(1)HIV-1  Vif  ja APOBEC3 

(2) HIV-1  Vpu ja Tetheriini

(3) TRIMalfa proteiinit ovat  solun antiretrovirusjärjestelmää

(3)  Byeongwoon Song.  TRIM5alpha (Ss. 47- 66)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Byeongwoon%20Song.%20TRIM5alpha

TIIVISTELMÄ
Isäntäsolujen TRIM5alfa proteiinit blokeeraavat  retroviruksen replikoitumisen varhaisessa vaiheessa viruksen tultua soluun vähentämällä RT-entsyymin  tuotteiden kertymistä. (RT on  käänteiskopioiva   entsyymi).
Vanhanmaailman kädellisillä  TRIM5alfaproteiinit pystyvät rajoittamaan HIV-1 infektion, kun taas  useimmlla uuden maailman apinoilla TRIM5alfaproteiinit pystyvät rajoittamaan SIV(mac) infektion.
TRIM5alfa proteiineissa on RING-domeeni, B-box2 domeeni, coiled coil-domeeni ja PRYSPRY-domeeni. Viimeksimainittu kohta määrää TRIM5alfan virusspesifisyyden  ja sen virusta rajoittavan kyvyn   tehokkuuden, koska sen kautta välittyy retroviruksen kapsidin tunnistus.  Coiled- coil- alue taas on TRIM5alfalle välttämätön, jotta se voi oligomerisoitua ja sitoutua viruksen kapsidiin.. Tehokkaaseen virusta rajoitavaan kykyyn  tarvitaan   myös RING domeeni ja B-box2 domeeni, vaikka mekanismia ei oltu selvitetty vielä 2009 aikoihin, ( jolloin kirja on julkaistu).

TRIM5alpha protein blocks retroviral replication at early postentry stage reducing the accumulation of reverse transcriptase products. TRIM5alpha proteins of Old World primates restrict HIV-1 infection whereas TRIM5alpha proteins of most New World monkeys restrict SIV(mac) infection. TRIM5alpha protein has a RING domain, B-box 2 domain, coiled-coil domain, and PRYSPRY domain. The PRYSPRY domain of TRIM5alpha determines viral specificity and restriction potency by mediating recognition of the retroviral capsid. The coiled-coil domain is essential for TRIM5alpha oligomerization, which contributes to binding avidity for the viral capsid. The RING domain and B-box 2 domain are required for efficient restriction activity of TRIM5alpha protein but the mechanisms remain to be defined.

( Kysymys: Miten ihmisen TRIM5alfa  geenit toimivat?)
Suom. 23.2. 2015 

HIV-1 viruksen lisäproteiini Vpu ja sen kohde, isäntäsolun tetheriini

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9 Sivut 2004
Kirjan sisällöstä
Toimittajien alkulause 2009.

Miten  HIV-viruksen lisäproteiini Vpu suhtautuu isäntäsolujen tekijöihin?

(2) Guatelli John C. Interactions of viral protein U (Vpu) and cellular factors ( Ss. 27-45)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guatelli%20John%20C.%20Interactions%20of%20viral%20protein%20U%20%28Vpu%29%20and%20cellular%20factors

TIIVISTELMÄ:
HIV-1 viruksen  yksi tai useampi lisägeeni koodaa virusproteiinia Vpu Kuten myös lisägeenituotteet Vif ja Vpr niin tämä Vpu kohdistaa  myös vaikutuksensa isäntäkehon johonkin proteiiniin.
Vpu kohdistaa  tehonsa  isäntäkehon eräissä solulinjoissa  esiintyvään  CD4- tunnukseen ja koettaa saada niitä  tunnusmolekyylejä tuhoutumaan  rekrytoimalla  solujen monialayksikköisiä  ubikitiiniligaaseja.
Vpu pystyy myös muodostamaan jonikanavia solun kalvoihin.
 Toisella näistä keinoista tai molemmilla Vpu  pystyy vastavaikuttamaan  isäntäsolun  niihin tekijöihin,  jotka rajoittavat uusien virionien vaputumista isäntäsolusta.
On havaittu, että avainasemassa oleva Vpu-tekijän kohdemolekyyli olisi  tetheriini, joka pystyy rajoittamaan viruksen replikoitumista pidättämällä  uusia vastamuodostuneita virioneja solun pintaan.  Tetheriini on nimeltään tarkemmin:  interferonin aikaansaama transmebraaninen proteiini  BST-2/CD317.

Viral protein U (Vpu) is encoded by one of several accessory genes of HIV-1. Like the accessory gene products Vif and Vpr, Vpu targets host proteins such as CD4 for degradation via the recruitment of cellular multi-subunit ubiquitin ligases. Vpu also forms ion channels in cellular membranes. Through one or both of these attributes, Vpu antagonizes host cell factors that restrict the release of progeny virions from infected cells.

A key target of Vpu has recently been identified as the interferon-induced transmembrane protein BST-2/CD317 (tetherin), which restricts viral replication by retaining nascent virions on the cell surface. The counteraction of this host defense allows Vpu to be considered an antagonist of the innate immune response to viral infection.

Käännös 23.2. 2015 

HIV-1-viruksen evaasiomenetelmä( Vif) solun APOBEC3- proteiinia vastan evaasi

Paul Spearman, Eric O.Freed ( Editors)
 Hiv Interactions with Host Cell proteins . 
Springer. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2009, siis ei aivan tuoreinta tietoa. ISBN 978- 3- 642- 02174-9 Sivut 2004
Kirjan sisällöstä
Toimittajien alkulause 2009.

(1) Niewiadomska Anna Maria, Yu Xiao-Fang.  Host restriction of HIV-1 by APOBEC3 and viral evasion through Vif (ss 1-25)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Niewiadomska%20Anna%20Maria%2C%20Yu%20Xiao-Fang.%20Host%20restriction%20of%20HIV-1%20by%20APOBEC3%20and%20viral%20evasion%20through%20Vif

Tiivistelmä:
On aivan jatkuva kilpailu virusten ja isäntäkehojen  asevarustuksen kehittelyssä. Solujen APOBEC-proteiinit tunnetaan tehokkaina lunnollisen immuniteetin puolustuskeinoina  sekä endogeenisiä retroelementtejä vastaan että erilaisia retroviruksia vastaan. Mutta nyt on kuitenkin retrovirukset  saaneet kehitettyä  viime vuosisadalla  omat vastahyökkäysmenetelemänsä. Useimmalla kädellisten LENTI-viruksella  on alkanut koodautua selllaista proteiinia, jota sanotaan Vif- proteiiniksi, Viruksen infektiivisyystekijäksi. Tämä Vif pystyy saamaan aikaan APOBEC-proteiineihin  tarkasti kohdistuvan  tuhoiskun asettamalla  niihin "osoitelipun (Ub-Ub-Ub---)  roskien käsittelyyn", proteosomisilppuriin, joka on  solujen ns.  Ubikitiini-proteosomitie. Tässä englanninkielisessä artikkelissa tehdään katsausta siitä, miten APOBEC3 (AG3)  tunnistettiin ja millä mentelmällä  APOBEC3-proteiinit pystyvät estämään retroelementtejä  ja myös  siitä, miten HIV-1 virus Vif-tekijänsä kehitettyään  hankki itselleen vastakeinoja, joilla se voi välttää  APOBEC3-prroteiinien  antivirusaktiivisuudet.

The arms race between virus and host is a constant battle. APOBEC3 proteins are known to be potent innate cellular defenses against both endogenous retroelements and diverse retroviruses. However, retroviruses have developed their own methods to launch counter-strikes. Most primate lentiviruses encode a protein called the viral infectivity factor (Vif). Vif induces targeted destruction of APOBEC3 proteins by hijacking the cellular ubiquitin-proteasome pathway. Here we review the research that led up to the identification of A3G, the mechanisms by which APOBEC3 proteins can inhibit retroelements, and the counter-mechanisms that HIV-1 Vif has developed to evade its antiviral activities.

Suomennos  23.2. 2015

Miten estää HIV-viruksen suuri variaatiokyky?

Tämä on  teoreettinen lähestymistapa, joka saattaa toteutuakin.
Sekä hypermutaatiot että hypomutaatiot  vaikuttavat retroviruksiin. Joko edistämällä hypermutaatiota tai  aiheutamallla hypomutaatiota voitaisiin vaikutaa viruksen elinvoiman vähenemistä.

Tausta: 
 Ihmiselläkin on antiretroviraali  geeninsä kromosomssa 22 ja siitä koodautuu APOBEC3- proteiiniperhe, joka pystyy selvittämään monet retroviraalit genomsiet  elementit genomista hypermuutaatiotietä , mutta HIV-1 on ihmiskuntaan tullut  poikkeus, koska se on kehittänyt itselleen tekijän Vif, joka hyökkää tämän  APOBEC3-järjestelmän  kimppuun ja käyttää sitä jopa hyödykseen, pakkaa sitä virioniin ja aiheuttaa säädeltyä   hypermutatoitumista variaationsa eduksi.
 Jos  APOBEC3 on normaalissa paikassaan sytosolissa, Vif-tekijä merkkaa sen ja kuljettaa  proteosomisilppuriin tuhoutumaan.
Kuitenkin sitä ehtii pakkautua myös virioniin ja se aiheuttaa hypermutaatiota, josta tuottuu dsDNA muotoa proviruksen integroitumisaan jälleen hieman  uudistuneessa  muodossaan.

On ajateltu, että ehkä  tätä APOBEC3 tekijää estämällä, vähennettäisiin HIV-viruksen mutatoitumiskykyä ja täten saatettaisiin  se luonnollisen  ja soluvälitteisen immuunivasteen  kapasiteetin alueelle takaisin  ja  tuhoutumaan, se kun pystyy pakenemaan  siltä vaikutusalueelta  suuren muuttuvaisuutensa takia.

 HIV Vif ikäänkuin säätelee  ABOBEC 3 määrää omaksi edukseen.
ABOBEC ensisijaisesti pystyy  muuttamaan    deaminaatiolla cytosiinin (C)  urasiiliksi (U). Se vaikuttaa ensisijaisesti  5´-CC  kohtiin muyta myös 5´-CT kohtiin.  Näistä  sitten johtuu, että proviruksen  GG voi muuttua lopulta  AG:ksi ja GA voi muuttua  lopulta AA:ksi. mikä on hypermutaatio. dsDNA muoto taas on  edellytys proviruksen integraatioon isäntägenomiin.
Kuratiivista, parantavaa, hoitoa ei HIV-infektioon ole ennenkuin voidaan estää sen proviruksen integroituminen genomiin.  On mahdollista edistää joko viruksen hypermutaatioitten määrää  niin että viruksen  vitaliteetti   väistyy tai  aiheuttaa hypomutaatiota, jolloin  ihmisen immuuninuistin vaste ehtii aiheutaa  viruksen  poistamisen.

Artikklei:
Refsland Eric W et. Reuben S. Harris.  The ABOBEC3 Families of Retroelement Restriction. In:  Intrinsic Immunity, Spirnger Link. 
Tässä kirjassa esitettiin ajatus  ABOBEC 3 inhibiittoreista.

Vastaavaa tekstiä löytyy netistä kuvan kera. Tällä hetkellä se on HIV Vif, joka tekee  APOBEC3 inhibition.
 Mutta APOBEC3 -inhibitiota  voidaan myös koettaa luoda  jollain lääkestrategiallakin,  jolloin Vif- modulaatiolla ei olisi virukselle sen vaatimaa  vitaalia  merkitystä.

Tämä ABOBEC3 järestelmä on sen verran merkitsevä, että jos se estetään,,  tilanne on oikastaan arvaamaton, sillä se suorittaa niin suurelle ainemäärälle  poistoa, mikä silloin ei tulisikaan poistettua kehosta- että  ei voi  arvioida  missä alkaa tulla haitan raja vastaan selaisessa  hyvin yksipuolisessa strategiassa. ABOBEC3:n normaalityö on niin näkymätöntä. Mutta HIV-1  teki sen näkyväksi keksimällä Vif- strategiansa.  Mutta kyllä monissa tuumoreissakin on  havaittu myös  APOBEC-. jräejstelmässä jotain epätasapainoa.  

SITAATTI netistä:  http://viralzone.expasy.org/all_by_species/3017.html

APOBEC3 protein family inhibition

In humans, the APOBEC3 family comprises 7 members: A3A, B, C, DE, F, G, and H that play important roles in antiviral response. For example, APOBEC3A is the predominant form in IFN- alpha treated monocytes suggesting that this isoform plays an important role in initiation of host defense against viruses. Biochemically, these enzymes catalyzes cytidine deamination in single-stranded DNA (ssDNA) mediated by a histidine and two cysteines, which form a catalytic center. This activity is particularly efficient against retroviruses during the reverse transcription phase. Apobec3-mediated hypermutation through deamination of viral genomes is very detrimental to further spreading the infection.
 

Viruses escape from the antiviral activity of APOBEC3 by using different mechanisms.
 The HIV Vif protein forms a complex with host APOBEC3F and APOBEC3G and prevents the entry of these lethally hypermutating enzymes into progeny virions.
 Vif recruits an active E3 ubiquitin ligase complex composed of elongin BC, CUL5, and RBX2 to induce polyubiquitination of APOBEC3G and thus degradation.
 The Bet protein from human foamy virus instead interacts with host APOBEC3C and thereby prevents its dimerization. This step is important since it was shown that formation of tetramers and higher-order homo-oligomers of APOBEC3 on ssDNA is required for efficient deamination.

YHTENVETO:
On parempi valita kapea tie: Mennä suoraan HIV- viruksen Vif- proteiinin kimppuun tässä asiasta, eikä  sokosti koko  APPOBEC3 proteiinijärjestelmän kimppuun.
Tästä on jo projekti: 
 http://sanfordburnham.flintbox.com/public/project/22668/

Ebolanvastaisessa taistelussa on uuteen vaiheeseen siirtymä käynnissä

Epidemia on tähän mennessä niittänyt lähemmä 9000 kuolonuhria.
Luvusta kuitenkin näkee, että  se ei ole kasvanut- niin kuin pelättiin- exponentiaalisesti syksystä, vaan on saatu lineaarinen  kasvukäyrä taipumaan pienempään kulmaan. Epidemia ei siis vielä ole ohi, vaan vaatii  tietyn uuden vaiheen  sen käsittelyssä.
WHO 1.2. 2015: Tapauksia ollut yhteensä 22 495. Kuolemantapauksia yhteensä   8981.

Ruotsin lääkärilehti Nr 6  mainitsee  tästä uuteen vaiheeseen siirtymästä  sivulla 201.
Michael Lövtrup. Kampen mot ebola in i ny fas   (Tekstin päivämäärä täytyy olla ennen päivää 4.2. 2015. Kts alla oleva WHO Situation rapport 4.2. 2015)
Suomennosta:
(Tammikuun) viime(isellä ) viikolla  esimmäisen kerran seitsemään kuukauteen uusien tapausten lukumäärä Länsi-Afrikassa oli  pienempi  kuin 100. WHO:n mukaan (28.1. 2015)  taistelu kuolettavaa virusta vastaan siirtyy nyt toiseen faasiin.
Nyt ei päämääränä ole ainoastaan viruksen  leviämisen jarruttaminen  vaan koetetaan saada aikaan epidemian  täysi pysähtymä, kirjoitetaan WHO:n viimeisessa ebolaraportissa.
 Tämän takia on  panostuksissa muutettu  keskiötä, fokusta, nopeasta  uusien  sairaanhoidollisten infrastruktuurien rakentamisesta  olemassaolevan kapasiteetin mitä  tehokkaimpaan käyttämiseen uusien tapausten havaitsemiseksi, näiden potilaiden  hoitamiseksi ja turvallisten  hautajaisten toimittamiseksi.
(Käännös  7.2. 2015  Lehti tuli 6.2. 2015).

Kuitenkin  uusin  WHO tieto on seuraava:
4.2. 2015  WHO mainitsee helmikuun toisesta viikosta  jälleen havaitun  tapausmäärän nousua yli sataan viikossa. (Sierra Leonessa 80 tapausta, Guineassa 39 ja Liberiassa )..

Sitaatti:  Current Situation

Ebola Situation Report - 4 February 2015

• Weekly case incidence increased in all three countries for the first time this year. There were 124 new confirmed cases reported in the week to 1 February: 39 in Guinea, 5 in Liberia, and 80 in Sierra Leone.
• Continued community resistance, increasing geographical spread in Guinea...

Ebola Situation Report - 28 January 2015

• The response to the EVD epidemic has now moved to a second phase, as the focus shifts from slowing transmission to ending the epidemic. To achieve this goal as quickly as possible, efforts have moved from rapidly building infrastructure to ensuring that capacity for case finding, case...

Ebola Situation Report - 21 January 2015

• Case incidence continues to fall in Guinea, Liberia, and Sierra Leone, with a halving time of 1.4 weeks in Guinea, 2.0 weeks Liberia, and 2.7 weeks in Sierra Leone. A combined total of 145 confirmed cases were reported from the 3 countries in the week to 18 January: 20 in Guinea, 8 in...

Hepatiiitti C viruksesta väitöstilaisuus tulossa

2015-02-20 : Impact of Host Genetic Variants on Natural History and Treatment of Hepatitis C Virus Infection

Rembeck, Karolina
Impact of Host Genetic Variants on Natural History and Treatment of Hepatitis C Virus Infection
Fredagen den 20 februari 2015, kl 09.00, Föreläsningssalen, Mikrobiologen, Sahlgrenska universitetssjukhuset/SU, Göteborg
http://hdl.handle.net/2077/37530
upp