Science- lehden artikkeli ebolagenomista (3) Sierra Leonen ebolavirustauti (EVD) ja tartunnanlähteiden etsintä

Maaliskuussa 2014 alettiin tarkkailla EBOV tilannetta  hallituksen Kenema -sairaalassa (KGH)  Sierra Leonessa  tämän vuoden taudinpurkauksen alkukohdan lähistöllä. Kenemassa suoritettiin  konventionellia PCR-perustuvaa  ebolavirusdiagnostiikka seuraten nykyisen ja aiempien purkausten kenttätyöhön perustuvien testien standardeja  (Kuva S2) Toukokuun  alussa olivat kaikki testit negatiivisia. Toukokuun 25. päivänä KGH:n  tiedemiehet vahvistivat Sierra Leonen  ensimmäisen  ebolavirustautitapauksen (EVD)  

In March 2014, Kenema Government Hospital (KGH) established EBOV surveillance in Kenema, Sierra Leone, near the origin of the 2014 outbreak (Fig. 1C and fig. S1) (6). Following standards for field-based tests in previous (7) and current (3) outbreaks, KGH performed conventional PCR-based EBOV diagnostics (8) (fig. S2); all tests were negative through early May. On May 25, KGH scientists confirmed the first case of EVD in Sierra Leone.

 Terveys- ja hygieniaministeriön suorittamat tutkimukset havaitsivat epidemiologisen yhteyden tämän sairaustapauksen  ja guinealaisia ebolavirustautisia hoitaneen kansanparantajan hautauksen kesken. Jäljitys johti 13   muuhunkin ebolatautitapaukseen- kaikki olivat hautajaisiin osallistuneita naisia. Tutkijaryhmä sai MoHS:stä, Sierra Leonen   etiikan   ja tieteellisten katsausten  komitealta   sekä USA.n instituuteilta eettisen hyväksynnän   USA.ssa   tapahtuvaan potilasnäytteiden  sekvensoimiseen  hyväksyttyjen turvallisuus standardien mukaisesti.

Investigation by the Ministry of Health and Sanitation (MoHS) uncovered an epidemiological link between this case and the burial of a traditional healer who had treated EVD patients in Guinea. Tracing led to 13 additional cases—all females who attended the burial. We obtained ethical approval from MoHS, the Sierra Leone Ethics and Scientific Review Committee, and our U.S. institutions to sequence patient samples in the U.S. using approved safety standards (6). 

 Tutkijat arvioivat neljä  toisistaan riippumatonta  alustusmetodia  ja kaksi sekventoimisohjelmaa ensimmäisellä ryhmällä, johon kuului 15 invaktivoitua ebolaravirustautinäytettä kahdestatoista potilaasta. Kaikkein täydellisimmät genomikoosteet ja luotettavimmat  isäntäkehon sisäiset  yksittäisten nukleotidivarianttien   (iSNV) tunnistukset saatiin Nextera- konstruktiolla ja Illumina - sekvensoimisella.
Samaa kombinaatiota käytettiin seuraavassa ryhmässä, johon kuului 84 näytettä  66 muusta  potilaasta ja tehtiin  kaksi toisistaan riippumatonta  replikaattia jokaisesta näytteestä ( Kuva 1D).
Lisäksi sekvensoitiin 35 näytettä epäillyistä EVD- tapauksista, jotka oli testattu negatiivisiksi ebolaviruksen (EBOV)  suhteen ja genominen analyysi paljastikin   näissä joitain muita tunnettuja patogeenejä kuten Lassa virusta, HIV-1 virusta, Enterovirusta A  ja malariaparasiittia ( Kuva S3).

We evaluated four independent library preparation methods and two sequencing platforms (9) (table S1) for our first batch of 15 inactivated EVD samples from 12 patients. Nextera library construction and Illumina sequencing provided the most complete genome assembly and reliable intrahost single nucleotide variant (iSNV, frequency >0.5%) identification (6).
 We used this combination for a second batch of 84 samples from 66 additional patients, performing two independent replicates from each sample (Fig. 1D). We also sequenced 35 samples from suspected EVD cases that tested negative for EBOV; genomic analysis identified other known pathogens, including Lassa virus, HIV-1, enterovirus A and malaria parasites (fig. S3). 

 Kaiken kaikkiaan tutkijat  saivat  muodostumaan 99 EBOV genomisekvenssiä seitsemältäkymmeneltäkahdeksalta (78)  varmistetulta  EVD potilaalta.jotka edustivat yli 70% (prosenttia) niistä potilaista, joilla oli diagnosoitu ebolavirustautia (EVD)  Sierra Leonessa myöhäisestä  toukokuusta kesäkuun  keskivaiheille mennessä.  He käyttivät  monia näytteenottometodeja ja ajankohtia kolmelletoista (13)  potilaalle (Taulukko S2). Saatu genomitieto kattoi yli 99,9% ebolaviruksen koodaavista alueista (Kuva 1,D ja E ja taulukko S2)

In total, we generated 99 EBOV genome sequences from 78 confirmed EVD patients, representing over 70% of the EVD patients diagnosed in Sierra Leone in late May to mid June; we employed multiple extraction methods or timepoints for 13 patients (table S2). Median coverage was >2,000x, spanning more than 99.9% of EBOV coding regions (Fig. 1, D and E, and table S2). 

 Tutkijat kombinoivat  Sierra Leonen 78 sekvenssiä  kolmen julkaistun guinealaisen  näytteen kanssa.( korjaten 21 todennäköistä sekvensoimisvirhettä jälkimmäisessa, jolloin saatiin 81 sekvenssin  tietuesetti). Näistä paljastuu 341 fiksoitunutta substituutiota  vuoden  2014 ebolaviruksen ja kaikkien muiden aiemmin julkaistujen  ebolavirusten välillä ( 35 nonsynonyymistä, 173 synonyymistä ja 133 ei-koodaavaa) sekä lisäksi 55  yksittäisen nukleotidin polymorfiaa (SNP) ( jossain potilasyksilöissä fiksoituneena esiintyvänä) Länsi-Afrikan taudinpurkauksessa  ( 15 nonsynonyymistä, 25 synonyymistä, 15 ei-koodaavaa).  Ebolavirus ja panfilovirusdiagnostiikaan käytetyissä viidessä  erilaisessa menetelmässä Sierra Leonen genomit eroavat  PCR luotaimista huomattavasti.

We combined the 78 Sierra Leonean sequences with 3 published Guinean samples (3) (correcting 21 likely sequencing errors in the latter (6)) to obtain a dataset of 81 sequences. They reveal 341 fixed substitutions between the 2014 EBOV and all previously published EBOV (35 nonsynonymous, 173 synonymous, 133 noncoding), with an additional 55 single nucleotide polymorphisms (SNPs) (fixed within individual patients) within the West African outbreak (15 nonsynonymous, 25 synonymous, 15 noncoding). Notably, the Sierra Leonean genomes differ from PCR probes for five separate assays used for EBOV and pan-filovirus diagnostics (table S3). 

 Deep- sequence coverage sallii tunnistaa 263  isäntäkehon sisäistä yksittäistä nukleotidivarianttia (iSNV) (73 nonsynonyymistä, 108 synonyymistä, 70 ei-koodaavaa ja 12  frameshift)  Sierra Leonen potilaissa.  Kaikissa  potilaissa, joiden näytteet olivat useista eri ajankohdista, sekvenssit yleensä  olivat identtisiä ja iSNV frekvenssit pysyivät  stabiileina.( kuva S4). Muuan huomioitava isäntäkehon sisäinen variaatio on glykoproteiinigeenin (GP)  RNA-luentakohta (Kuva S5A) , minkä tutkijat pystyivät potilaista luonnehtimaan.

Deep-sequence coverage allowed identification of 263 iSNVs (73 nonsynonymous, 108 synonymous, 70 noncoding, and 12 frameshift) in the Sierra Leone patients (6). For all patients with multiple time points, consensus sequences were identical and iSNV frequencies remained stable (fig. S4). One notable intrahost variation is the RNA editing site of the glycoprotein (GP) gene (fig. S5A) (10–12), which we characterize in patients (6).