(3) APOBEC proteiiniperhe, polynukleotidisytosiinideaminaaseja

(I) Eric W. Refsland et Reuben S. Hrris.  The APOBEC3   Family of Retroelement Restriction Factors. In: Intrinsic immunity  Toimittaja  on Bryan R. Culten ( 2013).
Current  Topics in Microbiology and Immunology.
 ISBN 978- 3- 642- 37764-8.

Nämä  Zn sinkistä riippuvaiset deaminaasit ( kuten APOBEC) katalysoivat sytidiinin  C  (cytidine) konvertoitumista  uridiiniksi U polynukleotidirakenteisissa substraateissa.  Tämä reaktio vaatii veden aktivoitumista  entsyymin koordinoimalla sinkkijonilla

Entsyymin aktiivissa kohdassa oleva glutamiinihappo protonoituu (N3) ja siten   valmistuu tietä  nukleofiiliseen hyökkäykseen,  joka kohdistuu  pyrimdiinirenkaan C4 asemaan ja tämä johtaa ammoniumin (NH3) vapautumiseen  ja  samalla  on urasiilia. tuotteena.
 Teoriassa tällainen reaktio voi tapahtua sekä RNA.ssa  että ss DNA.ssa  Kuitenkin  vain APOBEC1 pystyy editoimaan RNA:ta ja DNA:ta täten, mutta AID ja APOBEC3 ovat osoittautuneet sekä in vitro että in vivo kohdistavan vaikutuksensa   DNA- peräiseen substraattiin.

On tarkasti koetettu ottaa selville, voisiko APOBEC3 vaikuttaa  viruksen virionista  tulleeseen RNA- muotoon.
On tehty paljon kokeita. Eräässä koekeessa ( Harris et al. 2003)  APOBEC3 proteiinilla oletettavasti on mahdollisuus deaminoida virusgenomin RNA sytosiineja ennen kuin RT entsyymi (käänteiskopioitsija,  Reverse Transcriptase) lukee RNAsanoman ja  kääntää sen  (-) sense  ss cDNA-  välituotteeksi  (Heti kun  virusmuotona on yksittäinen DNA säie se altistuu  APOBEC3 deaminaaseille ja urasiloituu). Urasiloitunut  DNA editoituu edelleen- sisältäen nyt  urasiloitumisen jälkeisen  virheen  viruksen toistossa;  siitä taas  tulee  dsDNA, jota  välttämättä täytyy olla, jotta  virus voi sitä integroida isäntäsolun tumaan proviruksena. Siinä  muuntuma luennassa  siirtyy genomissa olevaan proviruseen.


Kaikkein tavallisimmat   APOBEC3- vaikutuksesta riippuvat mutaatiot, joita on havaittu integroituneen viruksen  DNA:sta, joka on selvinnyt  tästä  prosessista , ovat  genomisen  säikeen G.stä A:ksi tapahtuneet mutaatiot, mitkä oat  kokonaan  luettavissa sellaisiin deaminaatiotapatumiin, joissa cDNA miinussäikeen C  editoidaan  U:ksi.

On harvoin havaittua genomisen säikeen  C:n  editointi T:ksi  tapahtumia, jotka  mahdollisesti johtuvat RNA:n editoimisesta, on ajateltu. 

APOBEC3  DNA:ta editoiva aktiivisuutta  tarvitaan  selittämään aiemmin raportoitua G.stä A:ksi mutaatiobiasista in vivo HIV-1 substraateissa. 

Mikä on tyypillistä APOBEC3 entsyymien rakenteelle?

Näillä on  useita konservoituneita piirteitä, joista  voi saada oivallusta niiden funktiosta. 
Ne ovat kaikki globulaarisia proteiineja ja niissä on hydrofobinen ydin, jossa on viisi beetasäiettä kuuden alfahelixin ympäröimänä ja tunnuksena alfa2- beta3- alfa-3 sinkkiä koordinoiva motiivi.  3,4,5 betasäikeet  ovat paralleelit. kuten RNA:ta koodaavassa  entsyymissä (ADAT). Tämä rakenne lie avainasemassa, erottamassa polynukleotidit non- polynukleotideistä.

 Oligomerisaatio ei liene välttämätön  ssDNA-substraatteihin sitoutumisessa ja niitten deaminoimisessa.   Oligomerisaation merkityksestä in vivo ei vielä tiedetä varmasti, koska  APOBEC3G ja moni muu jäsen oligomerisoituu kuitenkin   in vivo.  Eri APOBEC3 -rakenteitten väliset eroavuudet   ovat  non-katalyyttisissä silmukoissa ja niitten erojen merkitys lie kohdentumsissa ja kofaktoreitten sitoutumsissa viitaten  fysiologisiin  funktioihin.

Miten nämä APOBEC3 entsyymit sitovat ss DNA:ta?

Nykyisesä työmallissa on  posiitivisesti latautunut  aktiivia kohtaa ympäröivä reuna-alue ja siinä esiintyy arginiinia R213, R215, R313 ja R320  APOBEG3G- entsyymissä.   Nämä aminohappotähteet  asentanevat  yksittäisen DNA säikeen  (ssDNA) sillä tavalla,  että kohteena oleva sytosiini (C) pääsee aktiiviin kohtaan. Tässä mallissa   cytosiini lipsahtaa esiin fosfodiesteritukirungostaan päästäkseen katalyyttiselle glutamaatille .(Base-flipping mechanism)   ( Emäksen esiinlipsauttava  mekanismi   on samantapaista kuin  adenosiini deaminaasilla TadA kompleksissa  RNA-substraattiin)  .
Tämä  reunamalli ja  TadA rakenteet  antavat selityksiä muihinkin paikallisiin ssDNA deaminaatio-preferensseihin, mitä  APOBEC- entsyymeillä on.
APOBEC3 perheenjäsenillä on huomattava preferenssi siihen emäkseen, joka sijaitsee  5´(prim) kohdalla sytosiinin vieressä.

AID erityisesti  suosii 5´puriiniemästä ( 5´-AC tai 5´-GC.
APOBEC3G suosii  5´-CC  siis sytosiinia.
Ja kaikki muut perheenjäsenet suosivat tymiiniä: (5´-TC) tässä dinukleotidissa.
useat tutkimukset ovat paikallistaneet tämän aktiivisuuden iettyyn silmukkaan, joka on aktiivij kohdan lähellä.
  Sitten on voitu tehdä  mainitun silmukan ymppäyksiä ja tutkittu vaikutuksia.
Jos  AID:n silmukan kohtaan ympätäänkin APOBEC3G silmukka, niin samalla muuttuu AID-entsyymin preferenssi vastaamaan  tätä APOBEC3G dinukleotidipreferenssiä.
Sama tapahtuu jos APOBEC3F silmukka  asetetaan  AID entsyymiin. 
Mutta jos sama silmukka vaihdetaan APOBEC3A:n ja APOBEC3G:n kesken , kaikki aktiivisuus katoaa. Se katoaa jo vaihtamalla silmukan yksi ainoa aminohappokin  (Rathore et al. 21013).
JATKUU...
...